20. Использование фагов в генетической инженерии в качестве векторов генетической информации.

Генная инженерия - это раздел молекулярной генетики, но, главное, - ветвь биотехнологии по созданию рекомбинативных ДНК (рекДНК) из различных видов организмов и вирусов, способных размножаться в реципиентной клетке или организме и детерминировать образование биологически активных веществ, обеспечивающих потребности народного хозяйства, биологии и медицины в частности. Генную инженерию иногда образно называют индустрией ДНК.

Конструирование генов

Конструирование комбинативных генетических структур, детерминирующих образование биологически активных веществ или других продуктов, основано на использовании двух методов - выделении (вырезании) генов и их синтезе – первый этап.

Передача и клонирование генов

На втором этапе генноинженерных работ выделенные и синтезированные гены с помощью рестриктаз вводят в кольцевые специализированные ДНК-векторы и сшивают их ДНК-лигазой в единую рекДНК, способную проникать в соответствующие клетки и благодаря наличию в векторах специфических ДНК-репликаторов, промоторов и терминаторов размножаться и избирательно накапливать генные продукты, что называют клонированием молекул ДНК.

В зависимости от того, в каких клетках реплицируются векторы, их делят на векторы прокариот, эукариот и челночные, содержащие репликаторы генетически неродственных организмов. В генной инженерии их получают от естественных репликонов: плазмид, бактериофагов, фаго-плазмид и вирусов.

Чаще всего из этих векторов используются плазмиды бактерий, особенно те, которые дают не 4-6 копий, как плазмида pSClOl кишечной палочки. В клетки животных гены вносят при помощи векторов, сконструированных на основе полиома-, папилома-, герпес-, адено-, ретровирусов и особенно ви­руса SV-40 и поксвируса осповакцины, в геном которого встраивают около 10% чужеродного генетического материала от его общей массы.

Для растительных клеток вектором могут служить плазмиды Ti Agrobacterium tumofaciens, вызывающие опухоли на корнях растений.

В тех случаях, когда подобрать вектор невозможно, прибе­гают к безвекторной передаче генов путем трансформации. Правда, передать гены таким образом удается только бактериям, включая их в питательную среду.

Частота трансформации бактерий, прежде всего, определяется степенью родства нуклеотидного состава ДНК донора и реципи­ента, на основе которого формируется трансформант, но зависит также от рН, ионного и белкового состава питательной среды, температуры культивирования и наличия особого фактора ком­петентности, имеющего структуру полипептида.

Компетентность бактерий, дрожжей, растительных клеток можно увеличить с помощью ферментов, разрушающих полисахаридный каркас оболочек и превращающих их в сферо- и про­топласты. Эффективность трансформации у бактерий возрастает при использовании хлорида кальция и теплового удара, а у эука­риот - полиэтиленгликоля, литиевых солей, высоковольтных импульсных электроразрядов, парагриппозного вируса Сендай, содержащего белок слияния.

И, наконец, некоторые возможности передачи генов откры­вает микрохирургия, позволяющая вводить чужеродную ДНК в ядра клеток.

В результате интенсивного развития генной инженерии всего лишь за последнюю четверть XX в. получены клоны многих ге­нов пептидных гормонов, инсулина, интерферона человека, овальбумина, коллагена, глобина, транспортных и рибосомаль-ных РНК, гистонов и некоторых других. Особый интерес для биологии и профилактической медицины представляют вакцины будущего на основе безвредных рекомбинантных вирусов, в ге­номы которых введены гены широко распространенных инфек­ционных вирусов, кодирующих один или несколько специфиче­ских антигенов. Все это явилось предпосылкой для создания «банков генов» про- и эукариот на основе эталонных штаммов эшерихий и винных дрожжей.