11 Определение интенсивности дыхания по количеству выделенного со2 (методом Бойсен-Йенсена)

В аэробных условиях пируват, образовавшийся в результате гликолиза, диффунди­рует из цитоплазмы в матрикс митохондрий и полностью окисляется до СО₂ с образо­ванием большого количества АТР.

Энергетика цикла Кребса. На каждую молекулу NADH или NADPH, окислен­ную в электрон-транспортной цепи митохондрий, образуется 3 молекулы АТР. При окислении одной молекулы FADH2 синтезируется 2 молекулы АТР.

При окислении глюкозы в гликолизе образуется две молекулы пирувата.

2 молекулы АТР и 2 молекулы NADH, обра­зованы в гликолизе.

Глиоксилатный цикл активно функционирует у некоторых бактерий и плесневых грибов, в семенах масличных растений и других объек­тах, где запасные липиды превращаются в сахара. Глиоксилатпый цикл представ­ляет собой модификацию цикла Кребса. Основные ферменты глиоксилатного цикла локализованы в специальных органеллах — глиоксисомах.

Пентозофосфатный путь окисления глюкозы, или апотомическое окисление глюкозы. Все реакции этого пути протека­ют в растворимой части цитоплазмы клетки, а также в пропластидах и хлоропластах. Пентозофосфатный путь окисления глюкозы особенно активен в клетках, в которых идет интенсивный синтез липидов, нуклеиновых кислот, элементов клеточной стенки, фенольных соединений. В ходе этого процесса синтезируется NADPH.

Цель занятия: Освоить методику определения интенсивности дыхания по количеству выделенного диоксида углерода.

Материалы и оборудование: проросшие и непроросшие семена, листья, стебли и др. растительный материал; 0,025 н раствор Ва(ОН)₂; бюретки; 0,025 н НС1; фенолфталеин; весы; конические колбы на 250-300 мл с резиновыми пробками; марля; дистиллированная вода.

Вводные пояснения

Для определения интенсивности дыхания по количеству выделенного диоксида углерода в замкнутый сосуд помещают навеску исследуемого материала, и определенное количество раствора щелочи. Выделяемый в процессе дыхания диоксид углерода реагирует со щелочью, в результате чего концентрация раствора уменьшается: Ва(ОН)₂ + СО₂ = ВаСО₃ + Н₂О. Через определенное время оставшуюся в сосуде щелочь титруют: Ва(ОН)₂ + 2НС1 = ВаС1₂ + 2Н₂О.

Сравнивают полученную величину с результатом титрования такого же количества исходного раствора щелочи. Последнее необходимо для определения исходной концентрации щелочи и одновременно для учета того небольшого количества СО₂, которое содержалось в сосуде до опыта, а так же поглощаемого щелочью во время открывания сосуда. Разность между результатами титрования контрольного и опытного сосудов прямо пропорциональна количеству выделенного при дыхании углекислого газа.

Продолжительность экспозиции зависит от размера навески и от интенсивности дыхания исследуемого объекта. При очень короткой экспозиции разность между результатами титрования контрольной и опытной колб будет недостоверной. Наоборот, если в колбе останется слишком мало барита, то может произойти неполное поглощение СО₂. Желательно поэтому подобрать такую экспозицию чтобы на связывание СО₂ было израсходовано 20-50 % щелочи (если, например, на титрование барита в контрольной колбе пошло 10 мл НС1, то на титрование раствора в опытной колбе должно пойти не более 8 и не менее 5 мл).

Ход работы

Поместить навеску исследуемого материала в марлевый мешочек и прикрепить его к пробке при помощи крючка, вставленного в пробку.

Провести пробную сборку установки, проверив, свободно ли проходит мешочек с материалом через горло колбы и не опускается ли он слишком низко. Внести в колбу 2-3 капли фенолфталеина и налить 10 мл раствора Ва(ОН)₂. Быстро опустить в колбу материал, слегка смочить пробку водой (для герметичности) и плотно (вращательным движением) закрыть колбу пробкой.

Записать время начала экспозиции.

Задачей работы будет сравнение интенсивности дыхания разных объектов. Для этого нужно взять две колбы и поместить в них листья и стебли одного и того же растения или проросшие и не проросшие семена и т.п. В контрольную (пустую) колбу также налить 10 мл барита и 2-3 капли фенолфталеина и плотно закрыть пробкой.

Колбы с объектами, содержащими хлорофилл, необходимо на все время опыта поместить в темноту для исключения процесса фотосинтеза.

Время от времени колбы следует осторожно покачивать, чтобы разрушить пленку ВаСО₃, препятствующую полноте поглощения СО₂, не допуская попадания ни одной капли раствора на мешочек с материалом.

Через 1-2 часа вынуть материал, быстро закрыть колбу пробкой и отметить время окончания опыта.

Оттитровать оставшуюся щелочь, приливая через отверстие в пробки 0,025 н НС1 до исчезновения розового оттенка. Чтобы избежать уменьшение концентрации раствора барита из-за поглощения СО₂ воздуха, следует провести титрование, закрыв колбу резиновой пробкой с двумя отверстиями, одно из которых закрыто трубкой с натронной известью, другое – плотно вставленным концом бюретки.

Контрольную колбу можно титровать через 20 мин после того, как налит раствор барита (за это время колбу необходимо периодически взбалтывать).

Задание 1. Результаты записать в таблицу

Растение	Навеска, г	Объем Ва(ОН)2, мл	Время			Расход НС1, мл		Поправка к титру НС1	Интенсивность, дыхания, мг/г/ч
			начало	конец	экспозиция, ч	контроль	опыт

Задание 2. Вычислить интенсивность дыхания (ИД) по формуле:

ИД = (а – б)•К•0,55/рt, (5)

где а – результат титрования содержимого контрольной колбы, мл;

б – результат титрования опытной колбы, мл;

К – поправка к титру НС1;

0,55 – количество (мг) СО₂ эквивалентное 1 мл 0,025 н НС1;

р – навеска, г;

t – экспозиция, ч.

Задание 3. Сделать вывод, сопоставив интенсивность дыхания различных растительных объектов.