Современные проблемы и методы биотехнологии

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.2. Методы молекулярной диагностики

ментный анализ, общую схему которого можно представить следующим уравнением:

АГ (или АТ) + АТ~Е (или АГ~Е) → АГ ~ АТ~Е + S → P,

где Е – это фермент; АТ~Е – антитело, меченное ферментном (химически синтезированный комплекс); S – субстрат данного фермента; Р – продукт ферментативной реакции, обладающий каким-либо визуальным признаком (окраской, флуоресценцией или люминесценцией).

Рис.3.5. Взаимодействие антиген – антитело

По интенсивности полученного от продукта сигнала судят о наличии и количестве молекулы-мишени. Широко распространенной разновидностью иммуноферментного анализа является так называемый ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA, по английской транскрипции названия метода). Схема такого анализа приведена на рис. 3.6.

Поскольку иммуноферментный метод получил весьма широкое распространение, поиск ферментов, как можно более полно удовлетворяющих всем требованиям, продолжается и в настоящее время. Весьма перспективными оказались биолюминесцентные ферменты – люциферазы – белки, одним из продуктов реакций которых является квант света в видимой области спектра. Все люциферазы считаются оксигеназами, т.е. катализируют реакции окисления субстрата молекулярным кислородом.

Перспективность аналитического использования люцифераз обусловлена высоким квантовым выходом биолюминесцентной реакции. Например, для люциферазы, выделенной из светляков, он составляет около 90 %. В настоящее время известно огромное количество различных биолюминесцентных животных, в основном морских, изучены их биолюминесцентные системы, клонированы гены люцифераз, установлены структуры и синтезированы молекулы субстратов. Особое место среди биолюминесцентных белков занимают Са2+-активируемые фотопротеины морских кишечнополостных. Мо-

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие

131

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.2. Методы молекулярной диагностики

лекула фотопротеина представляет собой стабильный фермент-субстратный комплекс, состоящий из односубъединичного полипептида (молекулярная масса около 20 кДа) и «преактивированного» кислородом субстрата, 2-гидропероксицелентеразина, прочно, но нековалентно связанного с белком. Биолюминесценция инициируется ионами кальция и возникает вследствие окислительного декарбоксилирования связанного с белком субстрата.

Рис. 3.6. Схема проведенияELISA: Е – репортерный фермент; S, Р – субстрат и визуальноопределяемый продукт фермента соответственно

В Институте биофизики СО РАН была клонирована кДНК одного из фотопротеинов – обелина гидроидного полипа Obelia longissima, сконструирован штамм E.coli – суперпродуцент апобелка и разработана высокоэффективная технология его выделения, позволяющая получать 50–70 мг высокоочищенного рекомбинантного обелина. Было показано, что белок стабилен при хранении в растворе и лиофилизованном виде, а также при проведении химических и генно-инженерных модификаций. Синтезированные конъюгаты с другими белками (авидином, иммуноглобулинами и др.) и гаптенами (биотином, тироксином) были использованы в качестве меток для иммуноанализа целого ряда диагностически важных веществ (альфафетопротеинов, гормонов различной природы, антител на инфекционные агенты) и продемонстрирована их перспективность и преимущества по сравнению с другими метками.

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие

132

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.2. Методы молекулярной диагностики

Это высокая чувствительность анализа, сравнимая с изотопной меткой (благодаря высокому квантовому выходу реакции (25–30 %) определяют атомолярные количества фотопротеина); практически полное отсутствие фонового сигнала вследствие высокой специфичности фотопротеина к ионам Са2+; практически неограниченный линейный диапазон зависимости биолюминесцентного сигнала от концентрации фотопротеина (при насыщающей концентрации Са2+ величина светового потока прямо пропорциональна количеству белка, поскольку он непосредственно участвует в реакции); простота запуска (надо только добавить раствор Са2+) и высокая скорость реакции (отсутствие дополнительных субстратов или кофакторов, биолюминесцентная реакция происходит в течение нескольких секунд); отсутствие токсичности. Наличие коммерчески доступных современных высокочувствительных фотометров, в том числе и планшетного формата, позволяет надеяться, что в самое ближайшее время биолюминесцентный иммуноанализ найдет широкое практическое применение в медицинской диагностике.

На рис. 3.7 показан пример использования обелина как репортера в ИФА тиреотропного (ТТГ) гормона в сыворотке. Можно видеть, что результаты биолюминесцентного определения этого гормона в сыворотках пациентов хорошо коррелируют с результатами РИА. Если чувствительность иммуноферментного анализа обеспечивается ферментативной реакцией репортера и чувствительностью инструментов для измерения соответствующего сигнала, то его специфичность зависит от аффинности иммуноглобулинов к моле- куле-мишени. Для получения иммуноглобулинов к данной мишени его очищенный (в случае белков) или дезактивированный (в случае патогенного организма) препарат используют для иммунизации экспериментальных животных. Антитела, которые при этом образуются в сыворотке (антисыворотке) животного (мыши, кролика и др.), представляют собой смесь иммуноглобулинов к различным антигенным детерминантам (эпитопам) мишени. Такую смесь антител называют поликлональными антителами. Их использование для некоторых методов диагностики имеет два недостатка:

1)содержание отдельных антител в поликлональном препарате может варьировать от одной партии к другой;

2)поликлональные антитела нельзя применять, если необходимо различить две сходные мишени, отличающиеся единственной детерминантой.

Внастоящее время используются моноклональные антитела, получаемые с помощью технологии гибридом. Эта технология состоит в создании клеточной линии, продуцирующей антитела одного типа, высокоспецифичные к одному эпитопу антигена-мишени. Известно, что В-лимфоциты, продуцирующие антитела, не могут воспроизводиться в культуре. В то же время клетки миеломы прекрасно пролиферируют и при их слиянии с лимфоцитами могут образовываться гибридные клетки, обладающие требуемыми свойст-

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие

133

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.2. Методы молекулярной диагностики

вами. Кратко процедура получения гибридных клеток состоит из следующих этапов:

1)клетки селезенки иммунизированных антигеном животных смеши-

вают с взвесью миеломных клеток, дефектных по гипоксантин-гуанин- фосфорибозилтрансферазе (HGPRT–) в 35 %-м растворе полиэтиленгликоля,

ивысевают в среду, содержащую гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда ГАТ);

2)на 10–14-е сут в среде остаются только слившиеся клетки селезенкимиеломы (остальные гибриды и исходные клетки погибают);

3)полученные гибриды выращивают на полной среде без ГАТ и идентифицируют с помощью иммунного анализа, затем субкультивируют, чтобы получить отдельные клоны.

Биолюминесценция	100				BLIA,млU/µ	60
						50
	10					40
						30
						20
	1					10
						0
	0.1	1	10	100		0	10 20 30 40 50 60
		[ ТТГ ], µМЕ/мл					µU/мл, RIA

Рис. 3.7. Схема (вверху) и результаты ( слева) биолюминесцентного иммуноанализа ТТГ сэндвич-типа. Справа – корреляция результатов биолюминесцентного (BLIA) и радиозотопного (RIA) методов определения содержания ТТГ в сыворотках пациентов (R = 0,96, n = 39)

Применение моноклональных антител позволяет существенно повысить специфичность иммуноанализа. Часто для определения одной мишени применяют два моноклональных антитела на разные эпитопы (сэндвичанализ): первое антитело используют для первичной сорбции антигена на поверхности, а второе, меченное ферментом, – для обнаружения антигена (см. пример на рис. 3.7).

Существующий рынок иммунодиагностикумов, поставляемых различными зарубежными и отечественными фирмами, чрезвычайно разнообразен (табл. 3.1).

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие

134

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.2. Методы молекулярной диагностики

Таблица 3.1

Важнейшие антигены определяемые коммерческими иммуноферментными диагностикумами

Полипептидные гормоны	Хорионический гонадотропин
	Гормон роста
	Лютеинезирующий
	Фолликулстимулирущий
	Тиреотропный гормон
	Пролактин
Маркеры опухолей	Канцероэмбриальный антиген
	Специфичекий антиген предстательной железы
	Рецептор интерлейкина-2
	Рецептор фактора роста эпидермиса
	Альфафетопротеин
Цитокины	Интерлейкины 1–8
	Колониестимулирующий фактор
Лекарственные препараты	Теофиллин
	Гентамицин
	Циклоспорин
Различные соединения	Тироксин
	Витамин В12
	Ферритин
	Продукты распада фибрина
	Tau-белок
Инфекционные заболевания	Хламидиоз
	Герпес
	Краснуха
	Гепатиты А, В, С, D
	Легионеллез
	СПИД
	Клещевой энцефалит

Рассмотренные нами варианты иммуноанализа представляют собой так называемые гетерогенные методы, когда иммунокомплекс формируется на поверхности, а непрореагировавшие и неспецифичные компоненты удаляются с помощью промывок. Существует другая группа методов, не требующих разделения компонентов (гомогенные методы). В основе гомогенного ИФА лежит потеря активности маркерного фермента в результате реакции АГ-АТ либо, наоборот, восстанавление активности фермента в результате реакции АГ-АТ. Как правило, эти методы не являются количественными и применяются для получения ответа «да» – «нет» (например, диагностирование беременности).

3.2.2. Методыдиагностики, основанныенаДНК-гибридизации

Иммуноанализ имеет свои ограничения: в случае диагностирования инфекционного заболевания с помощью него невозможно различить антитела индуцированные в результате прививки и в ответ на инфицирование; если

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие

135

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.2. Методы молекулярной диагностики

речь идет об особо опасных инфекциях, когда антитела не успевают образоваться или не образуются вовсе; если поражается иммунная система (СПИД); иногда он не в состоянии обеспечить необходимую чувствительность и т.д.

Незаменимыми и весьма эффективными в таких случаях являются методы, основанные на детекции определенных нуклеотидных последовательностей, – ДНК-гибридизационный анализ. Инфекционные агенты (бактерии, вирусы и пр.) представляют собой живые организмы, их информация заключена в генетическом материале. Фрагмент ДНК, детерминирующий данный биологический объект, имеет строго определенную нуклеотидную последовательность и может служить диагностическим маркером. Процедура любого гибридизационного анализа состоит в следующем:

1)иммобилизация одноцепочечной ДНК-мишени на твердой подложке (мембранный фильтр, поверхность планшета и т.п.);

2)спаривание меченной комплементарной последовательности (ДНКзондом) с ДНК-мишенью при определенных условиях (температуре и ионной силе);

3)удаление несвязавшегося ДНК-зонда;

4)детекция гибридных молекул зонд-мишень.

Таким образом, в процедуре ключевыми являются три компонента: ДНК-зонд, ДНК-мишень и метод детекции полученных гибридов (рис. 3.8). Специфичность анализа определяется ДНК-зондами, а чувствительность – методами детекции. В зависимости от ситуации используют зонды различной длины (20–100 нуклеотидов). Они представляют собой продукты химического синтеза или клонирования.

Рис. 3.8. Один из вариантов проведения ДНК-гибридизаци- онного анализа. В качестве метки используют изотопы, специфические гаптены, последовательности ДНК, белки

Для получения зондов клонированием проводят следующие процедуры: 1) расщепляют ДНК патогенного микроорганизма эндонуклеазой и клонируют в плазмидном векторе; 2) проводят скрининг рекомбинантных плазмид с использованием геномной ДНК как патогенного, так и непатогенного штам-

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие

136

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.2. Методы молекулярной диагностики

мов; 3) плазмиды, гибидизующиеся только с ДНК патогенного штамма, используют для получения видоспецифичных зондов. Эти зонды дополнительно проверяют на отсутствие перекрестной гибридизации с ДНК из различных организмов и на модельных образцах для определения чувствительности метода.

Химический синтез олигонуклеотидов еще 20 лет назад представлял собой сложную экспериментальную задачу, связанную с большими затратами времени и реактивов, поэтому олигонуклеотиды были достаточно дороги. В настоящее время получение олигонуклеотидов осуществляется с помощью автоматических синтезаторов, и исследователь должен только правильно определить, какая именно нуклеотидная последовательность необходима для решения поставленной задачи.

Во всех синтезаторах синтез осуществляется твердофазным методом, т.е. первый нуклеозид иммобилизован на поверхности нерастворимых полимерных частиц, а растущая цепочка экспонирована к реакционной смеси, в которой находятся все необходимые реагенты. Частицы упакованы в колоночных реакторах, через которые последовательно прокачиваются растворы веществ, обеспечивающих протекание процессов синтеза. С целью создания оптимальных гидродинамических параметров колонки частицы имеют сферическую форму и одинаковые размеры. Ключевыми мономерами для синтеза являются четыре производных нуклеозид-фосфорамидита (рис. 3.9), в которых все функциональные группы заблокированы защитными группами. 5'-гидроксильная группа каждого мономера защищена диметокситритильной группировкой (DMTr), которая легко удаляется при кислотной обработке, например, трихлоруксусной кислотой (ТХУ). По 3'-положению находится метилированная фосфитамидная группа.

Рис. 3.9. Мономеры для твердофазного фосфитамидного синтеза олигонуклеотидов (синтоны)

Экзоцикличные аминогруппы, находящиеся в составе гетероциклических оснований В (гуанина, аденина и цитидина) заблокированы группировками (ацильные остатки), которые удаляются в щелочных условиях по окончании синтеза. Такие мономеры называются синтонами.

Схема химического синтеза олигонуклеотидов приведена на рис. 3.10. Рассмотрим несколько примеров проведения гибридизационного анализа (рис. 3.11). На неподвижной матрице в качестве зонда иммобилизовали 20-звенный олигонуклеотид ЗI, комплементарный участку ДНК вируса гепатита С. В качестве неподвижной фазы использовали поверхности планшетов или полимерных частиц. Иммобилизацию проводили с помощью ковалент-

ной пришивки.

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие

137

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.2. Методы молекулярной диагностики

Рис.3.10. Схема химического синтеза олигонуклеотидов: Р– нерастворимый полимер или стекло – частицы, на поверхности которых фиксированы первые нуклеотиды и растущая олигонуклеотидная цепь; В1, В2… – нуклеотидные основания; DMTr – диметок-ситритил

Рис. 3.11. Схема проведения твердофазного ДНК-гибридизационного анализа. Для выявления гибридов использовали конъюгаты репортерного белка с авидином или стрептавидином

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие

138

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.2.Методы молекулярной диагностики

Вкачестве ДНК-матрицы использовали синтетический 30-звенный олигонуклеотид МI*, несущий на 3’-конце остаток биотина (*) (рис. 3.11, вариант А). После гибридизации и удаления непрореагировавших молекул (с помощью промывок) обнаружение образовавшихся комплексов проводили с помощью конъюгатов – стрептавидин-щелочная фосфатаза или стрептави- дин-обелин. Известно, что стрептавидин из стрептококка или его аналог ави-

дин из белка куриных яиц обладают чрезвычайно высоким сродством к биотину (Кд = 10–15 М). Эти белки состоят из 4 одинаковых субъединиц, каждая из которых имеет сайт связывания с биотином.

Таким образом, стрептавидин (или авидин) часто используют в качестве стабильного и специфического мостика для формирования межмолекулярных комплексов, в том числе и при иммуноанализе. Образовавшиеся комплексы со щелочной фосфатазой обнаруживали спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность продукта ее реакции с субстратом. Комплексы с

обелином обнаруживали, измеряя интенсивность светового потока, возникающего при добавлении ионов Са2+. На этом же рисунке показан другой вариант обнаружения гибридов (рис. 3.11, вариант Б) с помощью наращивания дуплекса ферментативным удлинением зонда с помощью Taq-полимеразы в присутствии биотинилированного производного дезоксиуридинтрифосфата

(dUTP*).

Другой вариант проведения гибридизационного анализа показан на рис. 3.12. В данном случае при проведении ПЦР были использованы химически синтезированные праймеры,имеющие на концах биотиновые группы. Полученные при этом биотинилированные ампликоны иммобилизовалина поверхности, предварительно активированной стрептавидином. Для обнаружения ампликонов использовали зонд, состоящий из двух частей – химически синтезированного фрагмента, комплементарного определенному участку матрицы, и поли-А-фрагмента, присоединенного с помощью терминальной трансферазы. После гибридизации полученные дуплексы обнаруживали с помощью обелиновой метки, представляющей собой химически синтезированный конъюгат обелина с олигонуклеотидом dT30.

Рис. 3.12. Вариант проведения твердофазного ДНК-гибридиза- ционного анализа. Специфический зонд содержит поли-А- последовательность, метка представляет собой химический конъюгат репортерного белка обелина с олигонуклеотидом dТ30

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие

139

ГЛАВА 3. МЕД-Я БИОТЕХНОЛОГИЯ: ОСНОВЫ МОЛЕКУЛ-Й ТЕРАПИИ И ДИАГНОСТИКИ СОЦ. ЗНАЧ. ЗАБОЛЕВАНИЙ

3.2. Методы молекулярной диагностики

Современные методы позволяют проводить диагностику на исходном материале (клинические образцы крови, кала, мочи, смывах слизистых) без дополнительной очистки. Если концентрация ДНК-мишени слишком мала, ее амплифицируют с помощью ПЦР.

Первым сертифицированным методом такого рода был метод определения Chlamidia и gonococci в 1988 г. Сейчас целый ряд фирм производят диагностические наборы для обеспечения нужд медицинских аналитических лабораторий. Некоторые коммерческие диагностикумы, производимые в США, представлены в табл. 3.2.

						Таблица 3.2
	Коммерческие инфекционные диагностикумы, производимые в США
		Время	Чувстви-	Специфич-
	Организм		тельность,		Образец	Производитель
		анализа	%	ность, %
	Chlamydia trachomatis	4 ч	96	100	Вагинальный	Digene
					мазок
	Neisseria gonnorhoeae	1-2 ч	99,2	99,3	Моча	Becton Dickinson
	Mycobacterium tuber-	3,5 ч	91	98	Слюна	Gen-Probe
	culosis
	MRSA	1,5 ч	91,7	93,5	Мазок из носа	Infectio Diag. Inc
	Group A Streptococci	24 ч	94,8	100	Фаренгиальный	Gen-Probe
					мазок
	Group B Streptococci	1,5 ч	94	95,9	Вагинальный	Infectio Diag. Inc
					мазок
	Gardnerella, Trichomo-				Вагинальный
	nas vaginalis, and Can-	45 мин	82–95	98–100		Becton Dickinson
					мазок
	dida spp.
	E. coli O157:H7	8 ч	99	99	Вода	Qualicon, Inc

Приведенные данные показывают, что современные диагностикумы являются высокочувствительными, скоростными и надежными.

В России также существует ряд фирм, производящих аналогичные диагностические наборы, одним из крупнейших является ООО «Вектор-Бест» (Новосибирск). Однако необходимо отметить, что, к сожалению, удельный вес импортных диагностикумов на российском рынке значительно выше отечественных.

Помимо обнаружения инфекционных агентов, ДНК-диагностика при-

меняется для выявления генов наследственных заболеваний. ДНК-анализ ис-

пользуют для выявления носителей генов заболеваний, а также для пренатальной и пресимптоматической диагностики генетических нарушений. Ранее для определения специфических мутаций использовали биохимические методы, основанные на выявлении продукта анализируемого гена. ДНК-тесты устанавливают мутации непосредственно в последовательности гена без экспрессии и изучения кодируемого белка. В настоящее время разработан целый

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие

140