Современные проблемы и методы биотехнологии

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»

1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии

Молекулярное, или генетическое, клонирование – процесс создания генетически идентичных молекул ДНК – является основой молекулярной биологии, фундаментальным методом биотехнологических исследований, а также основой развития и коммерциализации биотехнологии. Подавляющее большинство практических приложений биотехнологии, начиная с разработки лекарственных препаратов и заканчивая созданием трансгенных культур, основывается на методах генетического клонирования. С помощью молекулярного клонирования стали возможными: идентификация, локализация и описание генов; создание генетических карт и секвенирование целых геномов; проведение параллелей между генами и ассоциированными с ними признаками; установление молекулярной основы проявления признаков. Область применения клонирования чрезвычайно широка.

К числу перспективных направлений биотехнологии относится модификация генома культурных растений с целью повышения урожайности и улучшения их устойчивости к вредителям и неблагоприятным условиям среды. Наибольший интерес вызывает, естественно, возможность трансформации однодольных растений (прежде всего, злаковых).

Трансформация генома высших растений реализуется двумя методами: баллистическим и с использованием природной системы переноса генетического материала – части Ti-плазмиды (Т-ДНК) – Agrobacterium tumefaciens – возбудителя бактериального рака или корончатого галла у двудольных растений. В качестве маркерной системы используют гены антибиотикоустойчивости, а также новые системы – Lux-гены или ген бактериальной β-глюкуронидазы, вызывающий окрашивание селективной среды. Ti-плазмиды, модифицированные разными генами, переносят в растения. Перенос генетической информации с помощью Ti-плазмиды осуществлен и на примере однодольных растений: использовали ткани луковицы гладиолуса с удаленными боковыми частями. Цилиндрические эксплантанты заражали вирулентными штаммами агробактерии, несущими Ti-плазмиду, которая содержит гены, кодирующие синтез опинов; спустя 24 ч на поверхности зараженного растения появлялись опухоли. Специалисты Карнелского университета (США) предложили новый метод – стрелять по клеткам растений вольфрамовыми пулями, покрытыми генетическим материалом. «Обстрел» клеток-хозяина происходит со скоростью свыше 1 000 км/ч миллионом металлических дробинок, покрытых слоем фрагментов ДНК; метод оказался универсальным.

С помощью генетического конструирования стало возможным получение соле-, гербецидо- и морозоустойчивых растений. По оценкам специалистов, в США ежегодный ущерб от заморозков оценивается в 6 млрд дол. Оказалось, что наиболее активными центрами кристаллизации являются отдельные бактерии (представители Pseudomonas, Erwinia), способные вызывать образование льда при 0 оС; их назвали INA-бактерии – активные кристаллизаторы воды (Ice-nucleation Active). В этих бактериях идентифицирован специфический мембранный белок, вызывающий кристаллизацию; ice-гены были клонированы и модифицированы. Удаление средней части привело к по-

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие

41

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»

1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии

тери способности экскретировать белок кристаллизации. В результате бактерии с модифицированным ice-геном утратили способность кристаллизовать воду при −1–5 оС. Посев этих генетически модифицированных бактерий на растения в момент распускания почек препятствует колонизации другими бактериями, поэтому растения фактически иммунны для заражения INAбактериями дикого типа и им не страшны кратковременные заморозки.

Вторая волна «зеленой революции» ориентирована на получение генетически модифицированных «самоудобряющихся» растений. Установлено, что в составе генома азотфиксирующих симбиотических бактерий имеется группа генов, ответственных за симбиоз с растениями и локализованных в крупных симбиотических плазмидах pSym; процесс формирования клубеньков контролируют nod-гены и, наконец, nif-гены ответственны за синтез нитрогеназы, т.е. азотфиксацию. В настоящее время большие средства в США и других странах вкладываются в программу получения трансгенных злаковых с генами азотфиксации. Однако при переносе генов азотфиксации в высшие растения, помимо трудностей генетического характера, имеются и другие. Пока не изучена в должной мере регуляция взаимосвязи генов фиксации азота с генами, ответственными за синтез переносчиков электронов и кофакторов, необходимых для функционирования фермента нитрогеназы. Последняя должна быть защищена от ингибирующего воздействия кислорода. Ведутся также интенсивные исследования генетики растений для подбора эффективных растений-хозяев, а также исследования, направленные на модификацию генома микроорганизмов для получения организмов, способных существовать в симбиозе не только с бобовыми растениями (например, хлебными злаками). Фундаментальные исследования по переносу генов азотфиксации в высшие растения, по-видимому, приведут к многообещающим открытиям и коренному перевороту практики азотного питания растений.

Второе, весьма важное направление применения генетической инженерии, – придание культурным растениям устойчивости к заражению листогрызущими насекомыми. Природные фитопатогены, например бактерии Bacillus thuringiensis (Bt), синтезирующие токсины, эффективные против листогрызущих насекомых, стали источником генов для придания растениям устойчивости к этим вредителям. Синтез токсинов Bt контролируется одним геном, имеющиеся методы позволяют проводить работы, направленные на улучшение существующих продуцентов и продуктов Bt. Известно, что гены, контролирующие синтез кристаллов Bt, локализованы на небольшом числе плазмид значительной молекулярной массы. Токсический белок, синтезируемый Bt, клонирован в E. coli и B. subtilis, его экспрессия получена даже в течение вегетативной фазы роста. Есть сведения о клонировании белка, токсичного для бабочек, в клетках табака. В выросшем целом растении табака каждая клетка вырабатывала токсин. Таким образом, растение, приобретшее токсин, само становится устойчивым к насекомым: поедая листья, гусеница погибает, не причинив существенного вреда растению.

Американскими компаниями «Монсанто» и «Агроцетус» проведены полевые испытания и районированы сорта хлопчатника, сои и ряда других

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие

42

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»

1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии

культур с внедренным в хромосому геномом Bt. Резистентность к гусеницам передается семенам и последующим поколениям растений. Начато получение рассады трансгенного картофеля и томатов с внедренным геном Bt, токсичного для чешуекрылых. Создан трансгенный инсектоустойчивый тополь с внедренным геном антитрипсиназы в клетки тканей. Фермент снижает усвоение белка насекомыми, что приводит к сокращению популяции.

Клонированы гены устойчивости к гербицидам; их клонирование в растения призвано обеспечить безопасность применения ядохимикатов в сельском хозяйстве. Однако клонирование генов в культурные растения с о- пряжено с определенным риском. Опасения связаны с возможностями выхода генетических векторов и трансгенных растений из-под контроля биотехнологов. Поэтому высказываются опасения превращения генно-инженерных растений в сорняки, хотя комплекс «сорняковости» (комплекс признаков, обеспечивающих быстрое распространение в ущерб культурным растениям, устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов, эффективные механизмы рассеивания семян и пр.) едва ли может сформироваться в результате трансплантации одного или немногих генов. В то же время устойчивость к гербицидам, кодируемая одним геном, может вызвать существенные проблемы в практике севооборотов. Так, устойчивое к некоторому препарату растение, культивируемое на определенной площади, на следующий год при смене на этом поле культуры будет выступать по отношению к ней как сорняк, устойчивый к данному гербициду. Это предусматривает необходимость тщательного тестирования всех генно-инженерных растений перед их переносом в полевые условия.

Новый путь модификации генома – применение антисмысловых РНК, т.е. подавление синтеза определенного белка. Введение в клетку комплементарного олигонуклеотида мРНК препятствует считыванию информации. Использование данной технологии позволило получить сорт томатов, сохраняющихся длительное время за счет блокирования функции гена полигалактуроназы (расщепляет углеводы в клетке, стимулируя созревание), или кофе с низким уровнем кофеина в результате введения гена, подавляющего продукцию; т.е. это путь удаления неприятных горьких и прочих веществ из сельскохозяйственной продукции, подавления вирусных инфекций и т.д.

Генетическая инженерия животных направлена на выведение живот-

ных с высокими эксплуатационными свойствами. Методы генетической инженерии совместно с методом клонирования животных позволяют также получать модели для изучения заболеваний человека, процессов старения и формирования злокачественных новообразований. В будущем эти приемы могут быть использованы для разработки новых лекарственных средств и оценки эффективности таких методов лечения, как генная и клеточная терапии. Клонирование животных также предоставляет возможность спасения видов, находящихся под угрозой вымирания.

К биотехнологическим методам репродукции животных относятся искусственное осеменение, индукция родов, трансплантация, регулирование соотношения особей мужского и женского рода в популяции, это также ран-

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие

43

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»

1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии

няя диагностика беременности, применение гормонов для регулирования репродуктивных функций и роста и пр.

Искусственное разделение эмбриона является рутинным методом кло-

нирования. Метод дает возможность получения большого числа копий животных от высокоценных производителей. Возможно получение большого числа копий однояйцовых близнецов путем разделения зародышей в стадии бластулы или морулы на части. Эти части зародыша вводятся в пустые оболочки яйцеклеток свиньи, помещают в агаровые цилиндры на несколько дней, далее вводят в яйцеводы овец. Нормально развившиеся зародыши пересаживают хирургическим путем коровам-реципиентам на 6-7 день полового цикла. Выживаемость у половинок составляет до 75 %, у четвертинок – ниже, около 40 %. Образующиеся в результате этого эмбрионы внедряются в матку суррогатной матери, которая обеспечивает их вынашивание и рождение. Так как эмбрионы происходят из одной зиготы, они являются генетически абсолютно идентичными.

Манипуляции на эмбрионах используют для получения эмбрионов различных животных. Подход позволяет преодолеть межвидовой барьер и создавать химерных животных. Таким образом получены, например, овцекозлиные химеры. Первые эксперименты показали возможность трансформации генома животных генами человека, в США удалось получить свиней, несущих ген гормона роста человека. В Эдинбургском центре биотехнологии получены овцы с перенесенным фактором 9 человека, который секретируется в составе молока.

Новый метод – перенос ядра соматической клетки (или перепрограм-

мирование яйцеклеток) начинается с выделения из организма соматической клетки – любой клетки, не участвующей в процессе репродукции (т.е. любой, кроме половых клеток – сперматозоидов и яйцеклеток). У млекопитающих любая соматическая клетка содержит полный двойной набор хромосом (в каждой паре одна хромосома получена от материнской яйцеклетки, вторая– от отцовского сперматозоида). Геном любой половой клетки состоит только из одного хромосомного набора.

Для создания овцы Долли исследователи переместили ядро соматической клетки, полученной от взрослой овцы, в яйцеклетку, ядро которой было предварительно удалено. После проведения определенных химических манипуляций яйцеклетка с подмененным ядром начала вести себя как свежеоплодотворенная яйцеклетка. В результате ее деления сформировался эмбрион, который был имплантирован суррогатной матери и выношен в течение полного срока беременности. Появление Долли продемонстрировало возможность удаления генетической программы ядра специализированной соматической клетки и его перепрограммирования в лабораторных условиях методом помещения в яйцеклетку.

В течение 5-6 дней яйцеклетка развивается в эмбрион, генетически идентичный животному-донору. Клетки этого эмбриона могут быть использованы для получения любого типа ткани, которая при пересадке не будет отторгаться организмом донора ядра. Этот метод вполне может быть исполь-

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие

44

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»

1.3. Новейшие достижения в области биотехнологии

зован для выращивания клеток и тканей для заместительной терапии. Данный метод клонирования животных весьма активно используют в настоящее время. Совершенствование биотехнологических методов и средств диагностики и лечения, возможности ускоренными методами создавать эффективные породы сельскохозяйственных животных и сортов культурных растений– все это способствует повышению качества жизни человека.

Ощутим вклад биотехнологии в увеличение ресурсов минерального сырья и энергоносителей, а также в охрану окружающей среды. В связи с последним особо значимым становится направление, ориентированное на освоение экологически чистых новых материалов. Создание экологически чистых материалов с полезными свойствами остается одной из ключевых проблем современности. К настоящему моменту объемы выпуска не разрушаемых в природной среде синтетических пластмасс достигли 180 млн т/год, что создало глобальную экологическую проблему. Радикальным решением этой проблемы является освоение полимеров, способных биодеградировать на безвредные для живой и неживой природы компоненты. В этой связи в последние годы наметился существенный прогресс в области синтеза разрушаемых биополимеров – высокомолекулярных полимерных материалов, способных деградировать в природной среде до безвредных продуктов (диоксида углерода и воды).

1.4. Инновациивбиотехнологии: процедура коммерциализацииипередачитехнологий

Необходимость повышения качества жизни человека делает все более актуальной разработку новых средств диагностики и лечения, целевых продуктов, в том числе пищевого и технического назначения, экологически чистых материалов, усовершенствования способов воспроизводства энергоносителей и минерального сырья, а также утилизации промышленных, сельскохозяйственных и бытовых отходов. Все новые продукты биотехнологии, особенно пищевого и медицинского назначения, должны быть проверены на безопасность прежде, чем они будут допущены в практику. Для получения законодательного разрешения на применение новых биотехнологических продуктов, препаратов и технологий необходимо пройти серию этапов. Процесс прохождения всех этапов до промышленного выпуска называется пере-

дачей технологии.

На рис. 1.2 в обобщенном виде представлены этапы, обязательные для успешной передачи технологии производства продуктов биотехнологии биомедицинского назначения. Каждое направление передачи технологии имеет временные рамки, регулирующие последовательность шагов (этапов) процесса передачи технологии.

Успех продвижения новой технологии зависит от многих составляющих и, прежде всего, от организационного – правового процесса регулирова-

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие

45

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»

1.4. Инновации в биотехнологии: процедура коммерциализации и передачи технологий

ния всех этапов прохождения разработки, от стадии поисковых научных исследований до маркетинговых исследований и выхода на рынок. В России еще предстоит создать условия и механизмы для эффективной разработки и коммерциализации биотехнологических разработок, особенно в области медицинского материаловедения, тканевой инженерии и конструирования биоискусственных органов. В США и странах ЕС это уже сложившийся и регламентированный путь.

Каждый этап передачи технологии дает разный конечный результат и выдвигает разные требования к бюджету и персоналу. Прибыльность часто зависит от времени и затрат, вложенных в каждое направление. Финансовые затраты, связанные с направлениями, суммируются и должны точно прогнозироваться и выполняться, если нужно, чтобы процесс передачи был успешным. Движение к коммерциализации биотехнологической разработки состоит из серии последовательных этапов (рис. 1.3).

Исследовательское направление (2–10 лет) на практике зачастую бывает гораздо продолжительнее вследствие необходимости проведения испытаний новых материалов не только в системах in vitro, но и опытах над животными. Результатами этого этапа могут быть не только научные публикации и диссертационные работы, но также и патенты.

Практика показывает, что если есть возможность реализовывать одновременно все пять направлений, то суммарное время, необходимое для успешного процесса передачи технологии, может составить 8–10 лет. Однако, если приходится выполнять этапы последовательно, суммарное время почти удваивается (до 14–16 лет). Часто это происходит потому, что затраты, связанные с патентной защитой и демонстрацией технологии, обычно значительно больше затрат на исследования. При переходе от уровня исследований к последующим (патентование, маркетинг, демонстрация опытных образцов) в процесс принятия решений вовлекаются новые уровни управления; количество лиц, принимающих решения, увеличивается. Затраты на реализацию каждого последующего этапа возрастают, и при приближении к завершающим этапам процесса передачи технологии необходимые для этого объемы финансирования превосходят средства, которые выделяются университетами, фондами, мелкими компаниями. Критическим является переход от этапа 3 (маркетинговые исследования и оценка рынка) к этапу 4 (демонстрация технологии). На этом этапе потребность в финансировании возрастает на порядок. Помимо существенных финансовых затрат, переход на этот этап требует дополнительного персонала, управления, мощностей.

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие

46

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»

1.4. Инновации в биотехнологии: процедура коммерциализации и передачи технологий

Рис. 1.2. Продолжительность и последовательность этапов процесса передачи технологии

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие

47

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»

1.4. Инновации в биотехнологии: процедура коммерциализации и передачи технологий

Как правило, средства, направленные на реализацию этапа демонстрации технологии, выделяются без завершения этапа маркетинга и бизнесисследования. В маркетинге и бизнес-анализе предпринимается попытка прогноза соотношения затрат/доходов, необходимого капитала, размера рынка, времени выхода на рынок, процента проникновения на рынок, конкурентоспособности новой технологии, времени выполнения заказа по сравнению с конкурентами и т.д. Университетская и академическая наука не имеют персонала и опыта для проведения такого анализа. Для этого требуется заключить лицензионное соглашение. Зачастую происходят задержки, потому средства редко выделяются для запуска этапа 3 до тех пор, пока не будут выданы патенты (конечная точка этапа 2) и пока не будут подписаны лицензионные соглашения, но на это нужны время и деньги.

Этап 1

Проведение исследований

Этап 2

Патентование

Этап 3

Маркетинговые исследования и оценка рынка

Этап 4

Демонстрация технологии

Этап 5

Организация производства

Рис.1.3. Этапы, необходимые для проведения полного цикла процесса передачи технологии

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие

48

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»

1.4. Инновации в биотехнологии: процедура коммерциализации и передачи технологий

Опыт реализации биологических технологий показывает, что чем современней новая технология, тем труднее бывает провести маркетинговые и бизнес-оценки. Поэтому чем больше потенциал новой технологии, тем больше риск и дольше время, необходимое для принятия решение о том, что нужна поддержка для выхода на этап демонстрации технологии и проведения контроля качества продукта.

Переход от этапа 4 к этапу 5 (наращивание объемов от экспериментального уровня до уровня производства) требует еще более серьезных вложений средств и оценок рынка. При этом важно знание объема производственной базы, необходимой для достижения прогнозируемых небольших доходов. Тем не менее, при этом планируемая производительность производства должна быть сопоставимой с прогнозом продаж. Поэтому выделение прибыльных ниш на рынках в первые годы наращивания производства является ключевым требованием прогнозирования соотношения прибыли/риска для новой технологии. Большие корпорации обладают опытом и знаниями, для того чтобы выполнить такие оценки, но их большие накладные расходы приводят к раздуванию доходности, необходимой для успешной работы предприятия. Маленькие компании, наоборот, имеют низкие накладные расходы, но часто не обладают способностями точно оценить многочисленные факторы, действующие при переходе к промышленному этапу производства продукта.

Среди факторов, позитивно влияющих на ускорение процесса передачи технологии, можно выделить следующие:

–исследователи, отвечающие за создание технологии (этап 1) и патентование (этап 2), должны принимать участие в начальных этапах оценки рынка (этап 3), а также демонстрации технологии (этап 4);

–переходы между этапами 1-2-3 должны быть быстрыми и эффектив-

ными;

–лицензионные соглашения должны быть гибкими, для того чтобы обеспечивать быструю реализацию этапов 2, 3 и 4 одновременно, даже если информация по проведению оценки рынка (этап 3) является неполной;

–этапы с конкретными сроками реализации должны быть согласованы исследовательской командой, управленческой командой, командой маркетинга и разработки продукции, которые отвечают за этапы 3 и 4. Эти сроки должны быть согласованы вместе с бюджетами, в которые необходимо заложить премиальные стимулы, для того чтобы обеспечить приложение усилий по своевременному достижению целей;

–для реализации этапов 3 и 4 следует предусмотреть достаточный объ-

ем финансовых средств; которые должны предоставляться этапами, соответствующими этапам по выполнению каждого направления; при этом увязыва- – это один из путей обеспечения того, что капитал будет ориентирован на конечные результаты направлений, а не на то, чтобы его тратили для продолжения исследований.

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие

49

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ В ПРЕДМЕТ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ»

1.4. Инновации в биотехнологии: процедура коммерциализации и передачи технологий

Не секрет, что одной из причин задержки процесса передачи технологии является продолжение выполнения исследований на этапе 1 при ограниченных ресурсах вместо перемещения программы на этапы 3 и 4. Это часто происходит в университетах и академических учреждениях, где продвижение по службе, поощрения зависят от публикаций, что является основным конечным результатом этапа 1.

Если же технология создается внутри крупной коммерческой компании или корпорации, обычно действует структура управления, принимающая решения и бюджеты для этапов 2, 3, 4 и 5. Этапы и сроки часто навязываются как часть требований к выполняемой работе участвующих команд. В отличие от этого подхода, в условиях, когда технология создается внутри университета или государственной лаборатории, структура управления или бюджет для этапов 3 и 4 отсутствуют. В этом случае принцип состоит, как правило, в заключении лицензионного соглашения с компанией. Каждый этап процесса передачи технологии имеет разную степень риска, время и личные капиталовложения, связанные с ним.

 Современные проблемы и методы биотехнологии. Учеб. пособие

50