Генетическая инженерия и безопасность

41

5. Г Е Н Н А Я И Н Ж Е Н Е РИ Я Ж И В О ТН Ы Х

5.1. О сновные нап равлени я и дост и ж ени я генной и нж енери и ж и вот ных

Трансгенны е млекопитаю щ ие я вля ю тся луч ш ей моделью для из уч е- ния б олезней ч еловека, с другой с тороны , их планирую тиспользовать для производстванеоб ходимы х ч еловеку б иомедицинских препаратов.

П ервое транс генное животное б ы ло получ ено в 1982 г. Р.Д . П альмитером с соавторами. Э то б ы лагигантская мы ш ь, которой пересадили ген гормонаростакры с ы . П опы тки увелич ить таким же путем раз меры б олее крупны х млекопитаю щ их оказ алис ь неудач ны ми. Ж ивотны е с повы ш енны м уровнем индукции гормонарос тане увелич ивались в раз мерах, но у них наб лю дались знач ительны енаруш ения в ростеи строении костей .

Трансгенны е ж и вот ные – би ореакт оры	(“ би ологи чески е фабр и -
ки ”). Трансгенны е животны е получ или ш ирокое	распрос транение какб ио-

реакторы ,	т.е. продуценты б иологич ески активны х лекарс твенны х б елков
ч еловека,	с екретируемы х в молоко: гормонов, ф ерментов, антител, ф акто-

ров сверты вания крови и ростаи др. Традиционнотакиеб елки вы деля ли из донорской крови, деф ициткоторой и низ кая концентрация этих б елков не поз воля ли получ ать необ ходимого колич ествапрепаратов, покры ваю щ его запросы ф армакологич еского ры нка. Биореакторами могут б ы ть и б актерии, но б актериальны е клетки идут в перераб отку целиком и поэтому трудно изб авиться отпосторонних примесей в конеч ном продукте. Транс - генны е животны е поз волятреш ить и эту проб лему – оч истки лекарственны х б елков. Д аже если после оч истки в препарате останутс я примеси, э то б удут нетокс ич ны е для ч еловека б елки молока. Кроме того, микроорга-

низ мы нес пос об ны	осущ ес твля ть	пос ттранс ля ционны е модиф икации
сложны х эукариотич ес ких б елков		(гликозилирование, ацетилирование,
ф осф орилирование,	карб окс илирование и др.), необ ходимы е для их нор-

мального ф ункционирования . И звестно, ч то произ водимы е микроорганиз - мами б елки нередковы зы ваю таллергич ескиереакции.

С тратегия раб от в э том направлении такова: получ ить трансгенное животное, у которого ч ужой ген экспрес сируется в клетках молоч ной железы и его продуктвы деля тс я в молоко. И с пользование молокацелесооб - раз но потому, ч то оно об раз уетс я в организ ме животного в б ольш ом коли- ч ес тве, я вля етс я стерильны м и его можно надаивать по мере надоб ности б ез вредадля животного. Н апример, коз ав период лактации можетпроиз - вести до800 лмолокав год при содержании в нем рекомб инантного б елка около 5г/л, т.е. около 4 кг этого б елкав год. Таким об раз ом, относительно неб ольш ое с тадо транс генны х коз можетпродуцировать в сос таве молока сотни килограммов рекомб инантного б елкав год при его низ кой стоимости.

Ч тоб ы получ ить трансгенное животное, например коз у, создаю тгенетич ескую конструкцию , содержащ ую рекомб инантную Д Н К транс генаи промотор гена β-каз еина – б елка, входя щ его в состав молока. Т.е. под промоторами генов, специф ич ны х для молоч ны х желез (α-, β-каз еина, α-

42

моторами генов, специф ич ны х для молоч ны х желез (α-, β-казеина, α- лактоальб уминаили β-лактоглоб улина), вводя тцелевы е гены , которы е нараб аты ваю тб иологич ес ки активны евещ ества. Г енетич ескую конструкцию инъ ецирую тв з иготу. П рич ем, этаконструкция должнараб отать только в клетках молоч ной желез ы и только во время лактации, не оказ ы вая поб оч - ноговоздей с твия наорганизм транс генногоживотного.

В 1988 г. впервы е удалос ь получ ить трансгенны х овец, продуцирую щ их с молоком ф актор сверты вания крови, необ ходимы й для леч ения лю дей , б ольны х гемоф илией . В пос ледую щ ие годы в мире соз даны транс - генны е мы ш и, кролики, овцы и коз ы , свиньи, коровы , в молоке которы х секретирую тся б елки ч еловека (ценней ш ие ф армацевтич еские вещ ества): антитрипсин, антитромб ин, б елок С , сы вороточ ны й альб умин (использ уемы й при операция х), раз лич ны е моноклональны е антитела, эритропоэ тин, инс улиноподоб ны й ф акторроста, интерлей кины и др.

Так, с помощ ью гена α-антитрипсина ААТ , помещ енного под контроль промоторагенаβ-лактоглоб улина, б ы ли получ ены транс генны е овцы , в молоке которы х содержитс я до 35г/лэтого б елка. α-антитрипс ин я в- ля етс я ингиб итором протеаз ы э лас тазы . Л ица, у которы х отс утствуетэтот б елок, предрас положены кз аб олеванию э мф из емой легких и циррозом пе- ч ени в детском возрасте, так как у них постепенно распадаетс я соединительная ткань. Е го внутривенное введение с лужит для б ольны х лекарственны м с редс твом. И спользование трансгенны х животны х поз волитснизить б ольш инство дорогос тоя щ их вы сокоэф ф ективны х препаратов в 10-20 раз и перевести многие лекарстваиз разря даэлитны х в ч исло об щ едос тупны х. П ервы е в мире трансгенны е животны е (овцы ), продуцирую щ иес молоком прохимоз ин крупного рогатого с кота б ы ли получ ены в России в

1995 году. Х имоз ин –	клю ч евой ф ермент сы роделия , и традиционно его
вы деля ю тиз слизис той	об олоч ки с ы ч угаз аб иты х молоч ны х теля ти я гня т.

В б лижай ш ее время наф армакологич еский ры нокпос тупитпервы й лекар-

ственны й препарат из молока трансгенны х коз –	противосверты ваю щ ее
средс тво антитромб ин III ч еловека (использ уемы й	для предотвращ ения

инф арктов и инсультов), разраб отанны й американской ф армацевтич еской компанией “Genzyme Transgenics Corporation”.

Трансгенны е ж и вот ны е с выклю ч енным и генам и (генный нока-

ут ). Ген н ы йн окаут (отангл. knock out – вы б ить) или генны й таргетинг – это направленное разруш ение (вы клю ч ение) определенного гена с помо- щ ью гомологич ной рекомб инации. Больш ое з нач ение имею т опы ты по соз данию животны х, продуцирую щ их молоко, максимально приб лижаю - щ ееся по сос таву к материнскому молоку ч еловека. Д ля этого нужно вы - клю ч ить несколькогенов коровы , т.е. получ ить такназы ваемы х животны х- нокаутов, аз атем ввес ти в еегеном несколькогенов ч еловека.

Кроме того, животны е-нокауты я вля ю тс я удоб ной моделью для ис - следования ф ункций различ ны х генов. С ложность геномамлекопитаю щ их, их эмб рионального раз вития , длительны й период, предш ес твую щ ий раз - множению , з атрудня ю т проведение генетич еского анализ а. Больш инство

43

исс ледований в этой об ласти проводилось намы ш ах. М ы ш ь, относя щ ая ся ккласс у млекопитаю щ их, имею щ ая короткий с рокб еременности и рос такласс ич еский , удоб ны й об ъ ектгенетики. С оз дание линий мы ш ей , гомозиготны х по направленно инактивированному гену, поз воля ет из уч ать детерминируемы еданны м геном свой стванауровнеорганиз ма.

С хемаполуч ения нокаутны х мы ш ей (мутантов с направленно инактивированны ми генами) вы гля дитследую щ им об разом: 1. С оздание генетич еской конструкции (так наз ы ваемого н ац елен н ого вект ор а), содержа- щ ей ф рагментцелевого гена(которы й планирую тинактивировать in vivo), внутрь которого вс траиваю тдоминантны й селективны й маркер. 2. В ведение вектора (ч ащ е всего э лектропорацией ) в культуру э мб риональны х стволовы х клеток, отб ор клонов трансф ормантов населективной среде. С помощ ью П ЦР и б лоттингапо С аузерну вы я вля ю ттранс ф орманты , об ра-

зовавш иеся в результате гомологич ной рекомб инации,	приведш ей к ин-
серционно-делеционной инактивации целевого гена. О	тб ираемы е клоны

гетероз иготны по мутантному гену, т.к. инактивирую щ ая вс трой капроис - ходитв одну из гомологич ны х хромосом. 3. И нъ екция трансф ормированны х клеток в б ластоцисты , которы е з атем помещ аю т в я й цевод с амок. 4. С крещ ивание родивш ихся химерны х мы ш ей с мы ш ами ис ходной линии, получ ение гетерозиготного потомс тва по целевому мутантному гену; 5) скрещ ивание гетероз игот между соб ой , отб ор в потомстве гомоз иготны х по мутантному гену мы ш ей . Н акаждом э тапе генотип мутантны х мы ш ей определяю тс помощ ью П ЦР и б лоттингапоС аузерну.

Трансгенны е ж и вот ны е как генет и чески е м одели наследст вен-

ных заболевани й ч еловека. П о данны м с еквенирования геномау мы ш и и ч еловека содержится около 70-80% гомологич ны х генов (геновортологов). Н аэтом об ъ екте можно получ ать мутации, ос ущ ествля ть ген- но-инженерны е манипуля ции и изуч ать механиз мы регуля ции э кспрес сии генов, проводить скрещ ивание трансгенны х животны х и анализ наследования в потомс тве, ч то недопустимо с ч еловеком. Трансгенны е линии животны х использ ую тся для моделирования раз лич ны х генетич еских б олез - ней ч еловека, ч то имеет огромное з нач ение для медицинс кой генетики. П утем введения в геном мы ш и генов, ответственны х з аконкретноез аб олевание ч еловека, созданы “мы ш ины е”модели таких генетич еских б олез ней ч еловека, какб олез нь Альцгей мера(с тарч ескоес лаб оумие, дегенеративная б олез нь), артрит, атеросклероз , мы ш еч ная дис троф ия (миодистроф ия Д ю - ш енна), об раз ование опухолей , гипертония , сердеч но-сосудисты е и прионны ез аб олевания и др.

Н аос новеиз уч ения трансгенны х животны х раз раб аты ваю тся методы генной терапии (способ ы леч ения различ ны х нас ледственны х заб олеваний ). П ри этом используетс я соматич еская трансф екция - метод, когдагенетич еские конструкции вводя тс я в определенны е клетки и ткани организ ма пациента. Как и вс е другие методы леч ения , генотерапевтич ес кие методы разраб аты ваю тся и проходят ис пы тания на модельны х трансгенны х животны х.

44

Трансгенны е ж и вот ные – и ст очни ки органов для п ересадки ч ело-

веку. Знач ительны й интерес представля етсоздание трансгенны х животны х как источ ников органов для пересадки ч еловеку. О рганы с виньи, например, оч ень подходя тч еловеку по строению , раз мерам и многим б иохими- ч еским показ ателя м. С виньи сч итаю тся наиб олее подходя щ ими животны - ми в кач естведоноров сердцадля пересадки лю дя м, т.к. сердце свиньи по раз мерам наиб олее соответствует сердцу ч еловека и с ердеч ны е клапаны свиньи уже б олее деся тилетия ис польз ую тс я при кардиологич еских операция х на лю дя х. Клонирование трансгенны х свиней позволит создать постоя нны й з апас органов для пересадки лю дя м. Н о пересаживать их б ез генетич еского из менения (транс ф ормации) невоз можно, т.к. эти органы б у- дутнемедленно отторгнуты иммунной с истемой пациента. Ч тоб ы этого не произош ло, необ ходимо создать трансгенную с винью , у которой нокаутированы соответственны е гены гистонесовместимости (тканенесовместимости), авместо них введены гены гистосовмес тимос ти ч еловека. Э ти гены рас полагаю тся компактно в локусах гис тосовместимости, и при проведении генногонокаутаможновы клю ч ить сразу несколько генов.

Вя нваре2002 г. компания PPL Therapeutics pic об ъ я вилаорождении

вС Ш А пометов транс генны х клонов свиньи с отклю ч енны ми генами гис - тонесовмес тимости.

П олуч ение трансгенны х промы с ловы х ры б ведется в трех направления х: 1) увелич ения скорости их развития и приб авки весапутем введения в их геном генов гормонарос та; 2) повы ш ения их холодостой кос ти с помощ ью введенного генаAFP, кодирую щ его б елок-антиф риз; 3) придания ус той ч ивос ти квирус ны м з аб олевания м с помощ ью противовирусны х антис мы с ловы х РН К.

И нтересны и перспективны раб оты по созданию животны х - продуцентов б елкапаутины пауков, поскольку проч ность наразры в нитей паутины в расч ете наплощ адь попереч ного с еч ения напоря док превосходит проч ность стальны х канатов. Так, перенеся в геном коз гены паука, отве- ч аю щ ие завы раб отку паутины , американские и канадские генетики полу- ч или трасгенны х животны х, продуцирую щ их “б иосталь”– молоко, содержащ ее б елок, попроч ности превосходящ ий металл.

И так,	получ ение транс генны х животны х представляет интерес не
только для	ф ундаментальны х исс ледований , но и для практич еского ис -

пользования . О днако, несмотря на то ч то первы е трансгенны е животны е б ы ли получ ены б олее 20 летназад, до сих порнары нке нетни одного генетич ески модиф ицированного животного для ис пользования в хозя й ственной деятельности. Э то свя зано с определенны ми технич ескими (с ложнос ти получ ения и размножения ), ф инансовы ми, а иногда и этич ескими проб лемами. Тем не менее, ус пехи в генетич еской инженерии животны х оч евидны . Разраб отаны различ ны е методы перенос агенов в генетич еский материал животны х и получ ены трансгенны е особ и у млекопитаю щ их, низ ш их позвоноч ны х и у б еспозвоноч ны х животны х. У ч ены енауч ились не

45

только перенос ить в генетич еский материалживотны х отдельны е гены , но и “вы клю ч ать”или з аменя ть некоторы еконкретны егены .

5.2. Сп особы создани я т рансгенныхж и вот ны х

Е сли вводить Д Н К в клетки многоклеточ ного организ ма, то рез ультатом трансф ормации б удет изменение с вой ств лиш ь неб ольш ого ч ис ла клеток, которы е приоб рели новы й ген или гены . В э том случ ае животное б удетхимерны м (т.е. клетки разны х тканей б удутиметь раз ны й генотип). П оэтому для изменения свой ств вс его организманеоб ходимо из меня ть геном половы х клеток или з иготы (оплодотворенной я й цеклетки, представленной одной клеткой ), несущ их новы е свой ствапотомкам. В этом с луч ае трансф ормацию клеток ос ущ ествля ю тпутем микроинъ екции ч ужеродной

ДН К прямов я дроили, например, электропорацией .

Генетич еские конструкции ч асто с оздаю тс я наоснове Д Н К вирусов (например, SV40, вирусаб ы ч ьей папилломы и т.д.), ретровирусов, которы е

легко проникаю тв клетку хозя инаи встраиваю тся в ее Д Н К путем об ы ч - ной инф екции (например, путем инф ицирования рекомб инантны м вирусом эмб риона на ранних стадиях раз вития ). П ри вирус ной инф екции каждая клеткаможетполуч ить б ольш ое ч ис ло копий ч ужеродного гена. П еренос таким с пособ ом полез ны х генов оказ ался возможны м после ослаб ления

путем генно-инженерны х манипуля ций	патогенности вируса для клеток
организма-реципиента.
С ущ ествую т две ос новны е с хемы	соз дания транс генны х животны х.

П ервая из них – м и кр ои н ъекц и я чуж ер одн ойДН К (в составе генетич ес кой конструкции) в оп лодот вор ен н ую яйц еклет ку, раз раб отанная для получ е-

ния	транс генны х мы ш ей ,	которая поз днее сталаприменя ться для получ е-
ния	крупны х животны х –	продуцентов лекарственны х б елков ч еловека:
кроликов, коз, овец, коров. О птимальной			ф аз ой введения инородного ма-
териалая вляетс я стадия оплодотворенной			я й цеклетки до слия ния пронук-

леусов. П ронуклеус - одно из двух гаплоидны х я дер в я й це млекопитаю - щ их в период послепроникновения с перматозоида, но до с лия ния мужского и женского пронуклеус ов в я дро з иготы в процесс е оплодотворения ; мужс кой пронуклеус ф ормируетс я из ядерного материала с перматозоида, женский - из хромосом я й цеклетки.

В 1980 г. Д ж. Г ордоном б ы ло показ ано, ч то гены , инъ ецированны е в

пронуклеус оплодотворенного я й ца мы ш и, вс траиваю тся	в хромосомы и
прис утс твую т во всех клетках новорожденного мы ш онка.	С этой раб оты
нач алась эраполуч ения трансгенны х животны х.
П роцес с получ ения трансгенны х мы ш ей с помощ ью	микроинъ екции

схематич ески показ ан нарис унке 14. О н заклю ч аетс я в с ледую щ ем. Я й ц- клетки вы деля ю тиз самок-доноров, у которы х б ы лаиндуцированагиперовуля ция (увелич ение ч исла я й цеклеток до 35 вместо об ы ч ны х 5-10) и проведенос париваниес самцами-производителя ми (я й цеводы вскры ваю т-

46

Рисунок14. П олуч ениелиний трансгенны х мы ш ей методом микроинъ екций [Г лик, 2002], (поя снениев тексте)

ч ерез 12 ч асов после спаривания , вы деля ю топлодотворенны е я й цеклетки и помещ аю т их в культуру). Д алее в б ольш ий из двух пронуклеус ов (об ы ч но мужской ) инъ ецирую т транс генную конструкцию . П ос ле транс - ф ормации я й цеклетку немедленно имплантирую т в я й цевод (или матку) “приемной ”=”с уррогатной ”матери, которая произ водит потомство, или культивирую т в ус ловиях in vitro до с тадии б ластоцис ты (б лас тоциста = б ластула– зароды ш , э мб рион млекопитаю щ их наодной из ранних стадий раз вития ), послеч его имплантирую тв матку. Д ля отб оратрансгенны х осо- б ей (несущ их введенны й ген) проводятмолекулярно-генетич еский анализ родивш егося потомства. С крещ ивая трансгенны х животны х, можно полу- ч ить ч ис ты е (гомозиготны е) трансгенны е линии. Н едостатком традиционной технологии соз дания трансгенны х животны х путем микроинъ екции

47

генетич еских конструкций в пронуклеус я й цеклетки я вля ется ее трудоемкос ть и малоэф ф ективность. Так, полного раз вития достигаетменее 1-5% зигот, трансдуцированны х ч ужеродны м геном.

В торая схемаполуч ения трансгенны х животны х (б олее новая ) – вве-

ден и е ген ет и ческой кон ст р укц и и в эм бр и он аль н ы е ст воловы е клет ки

(Э С К=ES-клет ки ), вз яты еиз б ластоцисты (рисунок15). Э ти клетки я вля -

Рисунок15. П олуч ениетранс генны х мы ш ей с помощ ью генетич еской модиф икации эмб риональны х с тволовы х (ES) клеток[Г лик, 2002], (поя с нениев тексте)

48

ю тся недиф ф еренцированны ми, плю рипотентны ми (тотипотентны ми), т.е. способ ны диф ф еренцироваться в лю б ы е типы клеток, вклю ч ая клетки зароды ш евой линии. ES-клетки, вы деленны еиз э мб рионов настадии б ластоцис ты , можно культивировать in vitro и пос ле введения в них необ ходимого транс гена путем трансф екции (т.е. искусс твенного введения в клетки вектора, несущ его трансген) либ о инф ицирования рекомб инантны ми вирусами ввести в другой эмб рион нас тадии б ластоцисты , азатем имплантировать в матку “с уррогатной ”матери, производя щ ей потомс тво. С крещ и- вая животны х-основателей , нес ущ их трансген в клетках зароды ш евой линии, можно получ ить линии трансгенны х животны х. В отлич ие отметода микроинъ екции в оплодотворенную я й цеклетку з десь ещ е наэ тапераб оты с Э С К можно проанализ ировать встраивание транс генав геном клетки и проверить его экспресс ию , ч то дает воз можность вы б рать линию Э С К с наилуч ш ими с вой с твами. Ч асть этих клеток можно з амороз ить в жидком аз отеи хранить многие годы для последую щ его создания транс генны х животны х.

В первы е культивируемы е линии Э С К б ы ли получ ены из б лас тоцист мы ш и Э ванс ом, Кауф маном и М артином в 1981 году. П оз же они б ы ли получ ены из б ластоцис тмногих других млекопитаю щ их: золотисты й хомя - ч ок(1988); свинья , овца(1990); корова, норка(1992); кролик(1993); кры са (1994); об езья на (1995) и даже ч еловек (1994). Такой путь получ ения транс генны х животны х вы годен ещ е тем, ч то использ ую тся не зиготы , а б ластоцис ты , которы елегковы мы ваю тся из половы х путей с амоккрупны х видов млекопитаю щ их нехирургич еским путем. Затем получ аю т химерны еэ мб рионов (путем введения трансгенны х Э С К в полость б ластоцисты ), которы е трансплантирую тся нехирургич еским путем “суррогатны м”матеря м для рождения транс генны х животны х – ос нователей трансгенны х линий . Кроме того, Э С К – удоб ны й об ъ ектдля проведения в культурегенного нокаута (вектор з амещ ает соб ой или встраивается в нокаутируемы й ген).

С оздание трансгенны х животны х – оч ень трудоемкий процесс. Так, по статистике одно трансгенное животное удается получ ить на40 инъ ецированны х з иготмы ш и, или на100 зиготовцы или коз ы , или на1500 з игот

коровы . И з	этих трансгенны х животны х не б олее 50% экс прес сирую т –
транс генны й	б елок, не у вс ех животны х ч ужой ген попадает в половы е
клетки, т.е.	с пособ ен передаваться потомству. П оэтому б ольш ой интерес

вы зы ваю топы ты поклонированию животны х.

5.3. Клони ровани е ж и вот ны х

П од клоном об ы ч но подразумеваетс я популя ция клеток или организ мов – потомков одной клетки или организ ма, получ енны х неполовы м путем. Таким об разом, всеособ и в клонеимею тидентич ны й наб оргенов и должны б ы ть точ ной копией вз я того для размножения экземпля ра (соответствую щ его прототипа).

	49
Д ля	генетиков растений получ ение клонов не с оставля ет особ ы х
проб лем.	Клонирование растений ч еренками, поч ками, клуб ня ми в с адо-

водстве из вестно уже б олее 4 ты с. лет. Н ач иная с 70-х годов 20 векадля клонирования растений in vitro (вне организ ма, напитательной среде) с тали ш ироко использовать неб ольш ие группы и даже отдельны е соматич е- ские (неполовы е) клетки. Э то стало возможны м б лагодаря тому, ч то у рас - тений (в отлич иеотживотны х) по мере их ростав ходе клеточ ной специализ ации - диф ф еренцировки - клетки не теря ю тсвой с тво тотипотентности, т.е. способ ности реализовы вать всю генетич ескую инф ормацию , заложенную в я дре. П оэтому практич ески лю б ая растительная клетка, сохранив- ш ая в процес се диф ф еренцировки с вое я дро, может дать нач ало новому организму. Так, с использованием мерис тематич еской ткани взрослы х деревьев карельской б ерезы воронежские уч ены е (Н И И лесной генетики и селекции и В Г У ) напротя жении многих летус пеш но клонирую тхозя й ственно ценны е ф ормы с декоративной уз орч атой древес иной , которая ш и- рокоис пользуетс я в меб ельной промы ш ленности и кустарны х промы с лах.

У животны х генетики могутполуч ить подоб ны еклоны в том с луч ае, когдаиспольз уемы е ими об ъ екты раз множаю тся путем партеногенез а, т.е.

б ес полы м путем,	б ез предш ествую щ его оплодотворения . У нас в с тране
б лестя щ ие раб оты	по клонированию вы полнены наш елкопря де академи-

ком В .А. С трунниковы м. В ы веденны е ими клоны ш елкопря да (партеноклоны мужского пола, даю щ ие на 20% б ольш е ш елка, ч ем женские) из - вестны навесь мир.

В ы с ш ие животны е в природе размножаю тс я только половы м путем. Клетки животны х, диф ф еренцируя с ь, лиш аю тся тотипотентности. С ч ита- ю т, ч то в ходе клеточ ной диф ф еренцировки у позвоноч ны х происходит или потеря определенны х генны х локусов или их необ ратимая инактивация . В э том - одно из сущ ес твенны х их отлич ий отклетокрастений и главное препя тс твие для клонирования взрослы х позвоноч ны х животны х. П о- этому для клонирования взрослы х позвоноч ны х в ос новном ис пользую т

малодиф ф еренцированны е (не	прош едш ие специализ ации)		деля щ иеся
клетки.
Д ля клонирования животны х я дро оплодотворенной		я й цеклетки за-
меня ю тя дром, вз яты м отдругой	особ и (с другой генетич	еской	инф орма-

цией ). С об ственно я дро удаля етс я или инактивируетс я хирургич ески. О казалос ь, ч то тотипотентность (возможность раз виваться во взрослую особ ь) сохраня ю т я дра из клеток оч ень ранних эмб рионов. Когда ч исло клеток (б ластомер) э мб рионанепревы ш аетвосьми, они ещ етотипотентны и каждая из них можетдать нач ало новому организму. Э то поз воля етпроводить искусс твенное разделение 4-8 клеточ ны х э мб рионов наотдельны е клетки, культивировать их in vitro до стадии б ластоцисты и имплантировать в матку “приемной ”(с уррогатной ) матери, где они развиваю тся до рождения. Таким путем можно получ ать генотипич ески одинаковы е особ и (одноя й - цевы х б лиз нецов).

	50
Д ругая	воз можность з аклю ч аетс я	в использовании малодиф ф ерен-
цированны х	эмб риональны х стволовы х	клеток (Э С К =ES-клетки), полу-

ч аемы х из б ластоцисти характеризую щ ихся вы с окой с коростью деления . В этом с луч ае осущ ес твля ю тперенос я драиз стволовой клетки в энуклеированны е з иготы (т.е. в только ч то оплодотворенную in vitro я й цеклетку, из которой удалены об апронуклеус а), которы е затем имплантирую тв матку “приемной ”матери. Ч ис ло идентич ны х стволовы х клеток не огранич е- но, поскольку их можно клонировать. П оэтому колич ество получ аемы х одноя й цевы х б лиз нецов завис ит только от доступности я й цеклеток и налич ия “приемны х”матерей .

С использованием э мб риональны х клетокб ы лполуч ентеленокМ ис - терД жеф ф ерсон, клоны мы ш ей , порося т, об езья наТетраи др.

С енс ационность	раб оты доктора Я на В ильмута с	соавторами из
Ш отландии (1997г.) з	аклю ч ается в том, ч то впервы е для	клонирования

млекопитаю щ их б ы ли использ ованы ядр а сомат и чески х (ди ффер ен ц и р о - ван н ы х) клет ок взр ослойовц ы (клетки соединительной ткани – ф иб роб ласты ) б еломордой породы Ф инский дорс ет, вы деленны е из нижней ч ас ти вы мени овцы , находивш ей с я нач етвертом меся це б еременности. Беременное животное б ы ло вы б рано из -затого, ч то при б еременности клетки вы - мени активно деля тс я и, с ледовательно, хорош о вы живаю тв культуре. Я д- рапересаживалис ь в э нуклеированны е я й цеклетки овец ш отландской ч ерномордой породы , аз атем б ы ли имплантированы в матку “приемной ”матери ч ерноморды х овец. В результате поя вилась всемирно из вестная овца Д олли, генотипи ф енотип(б еломорды й я гненок) которой б ы ли полностью идентич ны исходной матери (рис унок16). М аркерами в данном случ ае

Рис унок16. С хемагенетич ескогоклонирования овцы [Короч кин, 2004], (поя снениев тексте)

служили масть овец и раз лич ны е микрос ателлиты в составе Д Н К . Э тот экспериментдоказ ы вает, ч то и с оматич ес кие клетки взрослой особ и могут б ы ть тотипотентны ми, у них отсутствую т необ ратимы е модиф икации генетич еского материалав ходе нормального развития . О днако процентвы -