Генетическая инженерия и безопасность

Ф Е Д Е РАЛ Ь Н О Е	АГ Е Н С ТВ О П О О БРАЗО В АН И Ю
В О РО Н Е Ж С КИ Й Г О	С У Д АРС ТВ Е Н Н Ы Й У Н И В Е С И ТЕ Т

О .С . М аш к ина, А .К . Б уторина

Г Е Н Е ТИ ЧЕ С К А Я И Н Ж Е Н Е РИ Я И Б И О Б Е ЗО ПА С Н О С ТЬ

И ЗБРАН Н Ы Е Л Е КЦИ И покурсу “Г енетикас ос новами селекции”

Уч ебноеп особи е

по сп ец и аль н ост и 011600 – би ологи я

Воронеж

2005

2

У твержденонауч но-методич еским советом б иолого-поч венногоф акультета27 октя б ря 2004 года, протокол№ 21

Авторы : М аш кинаО .С . БуторинаА.К .

У ч еб ное пособ ие подготовлено на каф едре генетики, с елекции и теории эволю ции б иолого-поч венного ф акультетаВ оронежского государс твенного универс итета

Рекомендуется для студентов б иолого-поч венного ф акультетадневной , ве- ч ерней и заоч ной ф ормы об уч ения

			3
			С О Д Е РЖ АН И Е
В В Е Д Е Н И Е	. . .	. . . . . . . . .	. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .	4
1. Г Е Н Е ТИ Ч Е С КАЯ И Н Ж			Е Н Е РИ Я . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .	5
1.1. Клеточ ная инженерия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .				5
1.2. Х ромосомная инженерия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .				7
1.3. Г енная инженерия . .			. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .	8
1.3.1. В екторная трансф ормация . О сновны еэтапы соз дания
транс генны х организмов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .				10
1.3.1.1. П оня тиеовекторе. Типы векторов, их конструирование. . .				10
1.3.2. М етоды переносагенов в клетки различ ны х организмов . . . .				17
1.3.3. Клонированиегенов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .				18
2. С О ЗД АН И Е И С КРИ Н И Н Г БАН КА Г Е Н О В . . . . . . . . . . . . . . . . . . .				18
2.1. П ринципы создания б анкагенов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .				19
2.2. В ы б орнужногогенаиз клонотеки (скрининг б анкагенов) . . .				20
3. Г Е Н Н АЯ	И Н Ж	Е Н Е РИ Я	М И КРО О РГ АН И ЗМ О В . . . . . . . . . . . . . . . .	24
4. Г Е Н Н АЯ	И Н Ж	Е Н Е РИ Я	РАС ТЕ Н И Й . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .	24
4.1. Агроб актериальная трансф ормация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .				24
4.2. В екторы наосновехлороплас тной и митохондриальной Д Н К . .				29
4.3. П реимущ естваи трудности ис польз ования рас тений как
об ъ ектадля генно-инженерны х исследований .. . . . . . . . . . . . . . .				31
4.4. Д ос тижения и перс пективы генной инженерии растений . . . . . .				32
4.5. Транс генны ерастения в с ельском хоз я й стве. . . . . . . . . . . . . . . .				38
5. Г Е Н Н АЯ И Н Ж Е Н Е РИ Я Ж И В О ТН Ы Х . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .				41
5.1. О сновны енаправления и достижения генной инженерии
животны х . . . . . . . .			. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .	41
5.2. С пособ ы создания транс генны х животны х . . . . . . . . . . . . . . . . . .				45
5.3. Клонированиеживотны х . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .				48
6. М Е Д И ЦИ Н С КИ Е АС П Е КТЫ Г Е Н Е ТИ Ч Е С КО Й И Н Ж Е Н Е РИ И
Ч Е Л О В Е КА .		. . . . . . . . .	. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .	52
6.1. Г енодиагностика. .			. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .	53
6.2. Г енная терапия , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .				54
6.3. М етоды генной терапии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .				56
6.4. П римеры практич еского применения генной терапии . . . . . . . . .				58
7. П РО БЛ Е М Ы БИ О БЕ ЗО П АС Н О С ТИ ТРАН С Г Е Н Н Ы Х
О РГ АН И ЗМ О		В . . . . . . .	. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .	61

7.1.П оня тиеоб иоб езопасности. П риродарисков для здоровья ч еловекаи окружаю щ ей среды , с вя занны х с использованием

трансгенны х организ мов, методы их оценки и способ ы
предупреждения . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .	61
7.2. Г осударственноерегулированиеб езопас ности генно-
инженерной деятельности в России . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .	67
РЕ КО М Е Н Д У Е М АЯ Л И ТЕ РАТУ РА . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .	69

4

В В Е ДЕ Н И Е

Г енетич еская инженерия – наиб олее перспективное направление современной генетики, имею щ ееважноенауч ноеи практич ескоез нач ение.

В раб отах по генетич ес кой инженерии ис пользую тс я как методы

класс ич еской	генетики,	так и самы е современны е б олее тонкие методы
молекуля рной	генетики	(такие как вы деление и идентиф икация генов, их

секвенирование, картирование, химич ес кий и ф ерментативны й с интез, генны й нокаут, гиб ридиз ация нуклеиновы х кислот, генная дактилоскопия

и др.). В пособ ии дается подроб ноеописаниенекоторы х из них.
Г енетич еская инженерия , как из вестно, вы с окотехнологич ны й	про-
цес с, ос нованны й наф ундаментальны х науч ны х з нания х, треб ую щ ий	вы -

сококвалиф ицированны х кадров и мощ ной науч но-технич еской б азы . П о- этому б удущ им специалис там в кач естве ос новы для проведения исследований по генетич еской инженерии необ ходимо иметь представление об основны х этапах создания трансгенны х организ мов, принципах конструирования рекД Н К, з нать процедуры по соз данию и скринингу б анков генов какисточ ников для получ ения и изуч ения ф ункций желаемы х для перено-

сагенов. С этими вопросами они могутоз накомиться в данном пособ ии.

Впрактич еском отнош ении генетич еская инженерия сталаодним из наиб олееэ ф ф ективны х методов селекции растений , позволя ю щ им с ущ ест-

венно сократить сроки создания новы х перс пективны х с ортов и получ ать их направленно путем непосредс твенного внедрения в растения желаемы х генов, минуя процесс гиб ридизации. М етоды генетич еской инженерии стали нез аменимы ми в ф армакологии. О ни поз волили получ ать ценны е лекарственны е препараты , использ уя живы е организмы в кач естве б иореакторов. Г енно-инженерны е методы находя твс е б олее ш ирокое применение в медицине, с тав ос новой генотерапии (леч ения генами), поз воливш ей из - леч ивать многиеранеенеизлеч имы енаследс твенны ез аб олевания .

В данном уч еб ном пособ ии можно най ти подроб ное описание примеров и методов клеточ ной , хромосомной и генной инженерии у микроорганиз мов, растений , животны х и ч еловека.

И с следования по генной инженерии проводя тся в науч ны х лаб оратория х и крупны х ф ирмах в наш ей стране и з аруб ежом достаточ но ш ироко, поэ тому с пециалис ты в этой об лас ти явля ю тс я вос треб ованны ми. Э то по-

служило основанием для	вы деления темы	по генетич еской инженерии в
самостоя тельное пособ ие,	ч тоб ы студенты	имели возможнос ть с амос тоя -

тельно подроб нее и глуб же ознакомиться с ней , поскольку время , отведенное для ее ос вещ ения в лекционном курс е, “Г енетика с основами селекции”огранич ено.

П ри написании пособ ия уч иты валось также то, ч то поступление в торговую сеть многих генетич ески модиф ицированны х продуктов вы зы ваетоз аб оч енность об щ ес твенности. П оэтому в пособ ие б ы лвклю ч енраздел по б иоб езопасности в свя зи с получ ением и ис пользованием генетич ески модиф ицированны х организмов. О тмеч ается , ч то во вс ех гос ударствах, где

5

проводя тс я исс ледования по генетич еской инженерии, приня ты соответствую щ ие з аконы и другие государс твенны е акты , соз даю щ ие нормативноправовую б азу для проведения таких исследований . П о Россий с кой Ф едерации указанадокументация , регламентирую щ ая получ ение и использование генетич ески модиф ицированны х продуктов. Э то особ енно важно, т.к. такая инф ормация в рекомендуемой с тудентам современной науч ной литературеполностью отсутствует.

П ри напис ании данного пособ ия б ы лаиспользованановей ш ая литературапо теме, в том ч исле и та, ч то мало доступнаш ирокому кругу ч итателей . П оэтому данное пособ ие может представля ть интерес для студен- тов-б иологов, ас пирантов, науч ны х сотрудников, вы полня ю щ их исследования по генетич еской инженерии, преподавателей , атакже для всех желаю щ их пополнить свои з нания по э той животрепещ ущ ей проб леме современной науки.

1. Г Е Н Е ТИ ЧЕ С К А Я И Н Ж Е Н Е РИ Я

Г енетическ аяинженерия – совокупнос ть методов создания живы х генетич ески измененны х организмов, вклю ч аю щ их ч ужеродны й генетич е- ский материал.

Ч ащ е всего генетич ескую инженерию отождествля ю т с генной инженерией , когдапроводя тся манипуля ции науровне Д Н К. В этом с луч ае осущ ествляю тсоздание генетич ес ки измененны х организ мов в рез ультате целенаправленного перенос ав них ч ужеродны х генов, кодирую щ их нужны е ч еловеку признаки и с вой с тва. В б олее ш ироком плане под генетич е- ской инженерией понимаю т и клеточ ную , и хромосомную , и генную инженерию , то есть генетич еская инженерия вклю ч аетоперирование (манипулирование) нетолькогенами, но и б олеекрупны ми ч астя ми генома.

1.1. К ЛЕ ТО ЧН А Я И Н Ж Е Н Е РИ Я

П римером клеточ ной инженерии у животны х я вля етс я получ ение

м он оклон аль н ы х ан т и т ел наос нове вы ращ ивания ги бр и дом . Ги бр и дом а –

клеточ ны й	гиб рид, получ енны й в рез ультате парасексуальной	(или сома-
тич еской )	гиб ридизации. П арас екс уальная гиб ридизация или	парасексу-

альны й процес с – это ф ормированиеклеток-потомков б олее, ч ем отодного родителя, в об ход мей оз а и оплодотворения ; ч асто встреч ается у гриб ов.

Ги бр и дом у получ аю т путем с лия ния нормальной	антителооб раз ую щ ей
клетки иммунной с истемы (лимф оцита) с миеломной	опухолевой клеткой .

Д елов том, ч то В -лимф оциты (В -клетки), синтез ирую щ иеантитела, не могутвос производиться и расти в культуре. Г иб ридомаоб ладает способ ностью ксинтезу моноклональны х антители кнеогранич енному росту наис - кус ственной питательной среде, так как об ъ единя ет в с еб е с вой ства нормальны х клетокиммунной системы вы раб аты вать с пециф ич ескиеантитела в ответнавведение определенного антигена(вещ ества, которое вос прини-

6

мается организмом какч ужеродное и вы з ы ваю щ ее специф ич еский иммунны й ответ) и спос об ность раковы х клетокнеогранич енно долго делитьс я в культуре. Г иб ридомы использ ую ткак эф ф ективное, хотя и оч ень дорогое средс тво против рака, атакже для из готовления вакцин, например, против я щ ура крупного рогатого скота, овец и с виней . Э тот энтеровирус представля ет опас ность и для ч еловека. В странах третьего мира я щ ур представля ет э ндемич ес кую б олез нь, принос я щ ую огромны й экономич еский ущ ерб . Д ля получ ения вакцины используется клонированное б елковое антителоэтоговируса.

Г иб ридизация соматич еских клетокживотны х использ уетс	я какме-
тод генетич еского анализ адля картирования генов, определения	их ф унк-

ций . С этой целью , например, проводя тгиб ридизацию клеток ч еловекаи мы ш и, ч еловекаи хомя ч каи др.

П римером генетич еской инженерии наклеточ ном и с вя занном с ним организменном уровня х я вля ется получ ение так назы ваемы х аллофен н ы х м ы шей, то ес ть мы ш ей , с одержащ их генотипич ески различ ны е ткани, получ енны е отраз ны х родителей . Д ля этого э мб рионы ч ерны х и б елы х мы - ш ей , дос тигш ие стадии вос ьми б ластомеров, из влекали из матки самки и с помощ ью определенного ф ермента разб ивали на отдельны е б лас томеры . С ливая б ластомеры отдвух или б оле зароды ш ей , создавали едины й комплексны й э мб рион. Такие э мб рионы нас тадии гаструлы вводили в матку мы ш и, у которой рождались мы ш атас тканя ми б елогои ч ерного цвета.

П римером клеточ ной инженерии у рас тений		я вля етс я получ ение со-
матич еских (парасекс уальны х)	гиб ридов путем	с лия ния	протопластов
(клеток, лиш енны х клеточ ной	с тенки) раз лич ны х видов и		родов. Такой

подход позволяет соединить в гиб ридной клетке генетич ескую инф ормацию я дра и цитоплаз мы далеких в систематич еском отнош ении организ - мов; получ ать ф ормы растений , которы е не сущ ес твую тв природе или которы е трудно получ ить половы м путем. С оматич еская гиб ридиз ация - спо-

соб введения важны х цитоплазматич еских генов, находя щ ихся		в мтД Н К
(например,	генов цитоплаз матич еской мужской стерильности)	и хлД Н К
(например,	генов ус той ч ивос ти к герб ицидам, патогенам). С оматич еские

гиб риды принципиально отлич аю тся отполовы х. П ервы е нас ледую твне- я дерны е гены отоб оих родительских растений , вторы е – только по материнс кой линии. В рез ультате слия ния протопластов можно получ ить генетич ески разнооб раз ны е гиб ридны е ф ормы : растения , гетерозиготны е по внея дерны м генам, ч то в свою оч ередь об ус ловливаетвоз можность полу- ч ения растений с раз лич ны ми комб инация ми цитоплаз матич еских генов; циб риды , содержащ ие я дро одного из родителей и цитоплаз му об оих родителей ; растения с пластомом одного родителя и митохондрионом другого. Кромеэтого, в результатеполной или ч астич ной э лиминации хромосом одного из родителей у отдаленны х соматич еских гиб ридов можетнаб лю -

даться	б ольш ое генетич еское разнооб раз ие, об условленное я дерны ми ге-
нами.	М етодом соматич еской гиб ридизации получ ены гиб риды между

культурны м и диким картоф елем, картоф елем и томатом, араб идопс исом и

7
турнепсом, турнепсом и капустой , пш еницей	и я ч менем, рисом и просом и
др.
1.2. ХРО М О С О М Н А Я И Н Ж Е Н Е РИ Я
И с пользование метода хромосомной	инженерии в опы тах В .А.

С трунникова(1971) имело важноетеоретич еское и практич еское знач ение.

С помощ ью	рентгеновского об луч ения В .А. С трунников сумел перенес ти
наполовую	W-хромосому самки (WZ) тутового ш елкопря дауч астокауто-
сомы (10-й	хромосомы ) с геном, об условливаю щ им темную окраску коко-

на(то ес ть путем транс локации). Г ен, об условливаю щ ий темную окраску, нас ледовался по женской линии и женс кие грены вс егда б ы ли темны е. С амцы (ZZ) и самки (WZ) в рез ультате раз вивалис ь из гренс раз ной окраской , ч то позволило отб ирать с амцов для промы ш ленного вы ращ ивания , таккакони об раз ую ткоконы на25 % продуктивнее, ч ем с амки, ч тодавало соответственноб ольш ий вы ход ш елка.

П римером хромосомной инженерии я вля етс я также получ ение организ мов с з амещ енны ми хромос омами. В этом с луч ае ос ущ ествля ю тз аме- щ ение целы х хромосом или отдельны х ф рагментов. Такой подход представля етб ольш ой интерес с точ ки з рения улуч ш ения сущ ес твую щ их сортов сельскохозя й ственны х растений , которы е несуткомплексы генов, определя ю щ их нежелательны е приз наки. Д ля з амещ ения хромосом, несущ их такие гены , необ ходимо предварительно соз дать серии м он осоми кови н улли соми ков луч ш их сортов. О рганиз мы , в диплоидном наб оре которы х от- сутствуетоднахромосома(2n-1), наз ы ваю тс я мон осоми кам и , парагомологич ны х хромосом (2n-2) – н улли сом и кам и . В С Ш А, например, серия моносомиков получ енадля сортапш еницы Ч ай низ С принг С ирс ом, ав Рос сии для сортапш еницы Безос тая 1 – О .И . М ай с тренкои сортаС аратовская 29 – под руководством В .К. Ш умного. П утем б екросс ов с моносомиками с тандартного сортав теч ение ш ести – семи поколений можно получ ить моносомикпохромосоме, намеч енной для з амещ ения . Затем, проведя самоопы - ление, отб ираю тдисомны е рас тения с двумя з амещ енны ми хромосомами. В ся раб отапроводится при строжай ш ем цитологич еском контроле. Н аб аз е моносомиков ос ущ ествлены также межвидовы е и межродовы е перенос ы хромосом. О соб ы й интерес представля етполуч ение у замещ енны х линий транс локаций между хромосомами пш еницы и ее далеких родственны х видов. Таким об разом С ирс, например, ос ущ ествилпередач у ус той ч ивости к лис товой ржавч ине сорту Ч ай низ С принг отэ гилопсаАеgilops umbellulata. С ходны м об разом пш енице б ы ли переданы сегменты хромосомы ржи и пы рея , нес ущ ие гены устой ч ивости кстеб левой ржавч ине и твердой головне. И звестны е русские сортаоз имой пш еницы Аврораи Кавказ содержаттранслоцированны й с егментхромосомы ржи в хромосоме пш еницы . В Н овос иб ирском институте цитологии и генетики С О РАН путем замещ е- ния отдельны х хромосом мя гкой пш еницы хромосомами ржи получ ены ф ормы пш еницы с б олее вы с оким содержанием б елкав з ерне, ус той ч ивы е кз асолению , раз лич ны м видам з аб олеваний .

8

1.3. Г Е Н Н А Я И Н Ж Е Н Е РИ Я

Г енная инженерия – это методы получ ения рекомб инантны х (гиб -

ридны х) Д Н К из ф рагментов геномов раз ны х организ мов, введение их в
клетку и об ес печ ение условий для экспресс ии ч ужеродны х генов.	П ри
этом можно ос ущ ествить направленное конструирование (создание)	орга-

низ мов с з аданны ми (нужны ми ч еловеку) свой ствами, ч то трудно (или не-

воз можно) с делать об ы ч ны ми методами – гиб ридиз ацией ,			мутагенез ом и
др.
В основе методов генной инженерии лежитспособ ность б актериаль-
ны х ф ерментов рес трикции (рестриктаз) рас щ епля ть Д Н К			на отдельны е,
довольно	короткие	нуклеотидны е последовательности.	Е стественной
ф ункцией	рестриктаз	я вля ется защ ита б актерии от инф екции вирус ами.

Э ти ф ерменты рес трицирую т(т.е. огранич иваю т) воз можность размножения ф аговой Д Н К в б актерии путем разрез ания ее нач ас ти. Ф ерментрестрикции не может расщ епля ть свою соб ственную (б актериальную ) Д Н К, т.к. в с ай тах рестрикции б актериальная Д Н К модиф ицированаметилированием, которое осущ ес твля етс я особ ы м ф ерментом – Д Н К -метилаз ой . В б актериальной клетке с ущ ествует сис тема рестрикции-модиф икации. О п- ределенны е рестриктаз ы специф ич ески узнаю ттолько с вои «миш ени», состоя щ иеиз 4-6 пни разрез аю тД Н К в середине или нескольков с торонеот этой пос ледовательности, делая соответс твенно пря мы е или ступенч аты е разрезы в об оих цепя х Д Н К (рисунок 1). В пос леднем случ ае об разую тся “липкие”(вы ступаю щ ие одноцепоч еч ны е) концы , которы е б лагодаря ком-

плементарности оснований могутвновь замы каться с об разованием	водо-
родны х с вя зей . Т.е. концы , сф ормировавш иеся под дей ствием одной	и той

же рестриктаз ы , могутгиб ридиз ироваться между соб ой . Э то об ес печ ивает воз можность об ъ единения раз лич ны х молекул Д Н К и создание рекомб и- нантны х (гиб ридны х) молекул Д Н К . Рестриктаз ы б ы ли наз ваны б иологи- ч ескими ножами, которы ми манипулирую тгенны е инженеры или генны е

хирурги.	HaeIII
EcoRI

C G A A T T C C A T A G G C C G C

G C T T A A G G T A T C C G G C G

C G
G C T	T	A A

A A T T C C A T A G G	C C G C
G G T A T C C	G G C G

“липк ие”к онц ы

“тупы е”к онц ы

Рисунок1. П ос ледовательность нуклеотидов, содержащ ая с ай ты (сай ты рестрикции), рас поз наваемы еразлич ны ми рестриктазами

9

П римером рес триктаз, об раз ую щ их “липкие концы ”, явля ю тся ш и- роко использ уемы е в генно-инженерны х раб отах ф ерменты б актериального проис хождения - EcoRI (присутствуету E.coli) и BamHI (об наруженав клетках Bacillus amyloliquefaciens). Н апример, EcoRI рас поз нает последовательность из 6 нуклеотидов (GAATTC), делая с тупенч аты еразрезы между нуклеотидами G и А (рис унок1), HaeIII – уз нает4 нуклеотида(GGCC), делая пря мы е разрезы и об раз уя “тупы е”концы . Д ля соединения “тупы х” концов к ним ф ерментативны м путем присоединя ю т “липкие”концы .

Ф ерменты рестрикции об оз нач аю т по наз ванию организ мов,			из которы х
они из олированы . И спольз ую т три б уквы из наз вания видаб актерии,				на-
пример,	EcoRI из E.coli, HindIII – из Haemophilus influenzae,		HaeIII –	из
Haemophilus aegyptius и т.д.		П ос ле трех б укв курс ивом следую т опреде-
ленны й	б уквенны й символ,	об оз нач аю щ ий генетич ескую	линию	или

ш тамм, и римская циф ра. В настоя щ ее время извес тно б олее 400 рестриктаз, способ ны х рас щ епля ть Д Н К в раз лич ны х сай тах.

Ф ормальной датой рождения генной инженерии сч итаю т1972 г., когдагруппаБергав С Ш А соз далапервую рекомб инантную молекулу Д Н К (рекД Н К), об ъ единивш ую в своем составе генетич еский материал из трех источ ников: полны й геном онкогенного вирусаоб езья нSV40, ч ас ть генома умеренного б актериоф агаλ и гены лактозного оперонаE. сoli. С конструированная рекомб инантная молекулане б ы лаисс ледованаф ункционально, так как у авторов этой раб оты возникли опасения , ч то методы генетич е- ской инженерии могутпривести квозникновению микроорганиз мов, опас -

ны х для здоровья ч еловека, например б актерий	Е. сoli, с пособ ны х перене-
сти онкогенны е вирусы в киш еч ник ч еловека.	П оэтому международны м

науч ны м с ооб щ ес твом б ы ло приня то реш ение проводить такие исс ледования под с трожай ш им контролем состороны государства.

О с новны ми з адач ами, стоя щ ими перед генной инженерией сегодня , я вля ю тся – б орьб ас б олез ня ми и производствопродовольствия .

Технология переносав геном растений , животны х, микроорганиз мов ч ужеродны х генов (т р ан сген ов = целевы х генов) и их передач ав ря ду по-

колений назы вается	т	р ан сген езом	или т р ан сген озом	(от англ.
transgenesis). П рич ем,	их	направленны й	перенос может ос	ущ ествля ться

между далеко разоб щ енны ми в ф илогенетич еском отнош ении организмами. Н апример, в геном растения можновс троить гены животны х, ч еловека, б актерий , других растений , в результате ч его клетки нач инаю твы раб аты - вать новы е продукты (нес вой ственны е данному организ му). О рганиз мы , получ енны е в результате переноса в их геном (с помощ ью генноинженерны х методов) ч ужеродны х генов, наз ы ваю тс я т р ан сген н ы м и (их ещ е наз ы ваю т ген ет и чески моди фи ц и р ован н ы м и - Г М ). Э то ф ормы с су-

щ ественнореконс труированны ми геномами. П роцесс, в рез ультатекоторого ч ужеродная Д Н К проникаетв реципиентную клетку и вы з ы вает у нее нас ледуемы еизменения , наз ы ваю тт р ан сфор мац и ей. Трансф ормацию клеток могутосущ ествлять как молекулы Д Н К, реплицирую щ иес я в клетках

10

внехромосомно (плаз миды ), таки молекулы Д Н К, интегрирую щ иеся в геном клетки (хромосомы ).

Е сли процес с транс ф ормации у б актерий (то есть перенос генов от одного ш таммаб актерий к другому) можно осущ ествить с помощ ью рас - творимы х ф рагментов Д Н К , нез ависимо оттого, живы е клетки или мертвы е, то попы тки провести трансф ормацию у эукариот с использованием препаратов тотальной геномной Д Н К не привели к ожидаемы м рез ультатам. Х отя доказ анны м примером ес тественной трансф ормации у млекопитаю щ их и у ч еловека я вля ется внедрение в хромосому клетки-хозя ина Д Н К онкогенноговируса.

П оложительны е воспроиз водимы е экспериментальны е рез ультаты у эукариотб ы ли получ ены толькос помощ ью в ек торной трансф орм ац ии.

1.3.1. В ект орная т рансф орм ац и я.

О сновны е эт ап ы создани я т рансгенныхоргани зм ов

О с новны ми этапами соз дания транс генны х организмов я вля ю тся следую щ ие:

1. П олуч ение нужного гена (трансгена), намеч енного для перенос а.
Г ен можетб ы ть вы делен из естес твенны х ис точ ников (из подходя щ его ге-
нома)	или геномной б иб лиотеки. О н может б ы ть синтезирован ис кус ст-
венно:	химич еским путем (по имею щ ей ся пос ледовательности нуклеоти-

дов) или ф ерментативны м путем с использованием механиз ма об ратной транскрипции (с интез кД Н К на матрице мРН К с помощ ью об ратной транскриптаз ы ), получ енс помощ ью полимераз ной цепной реакции (П ЦР).

2. С оз дание с пециальны х генетич еских конс трукций – векторов (переносч иков), в с оставекоторы х гены (трансгены ) б удутвнедря ться в геном другоговидаили клонированы в клетках проили э укариот. Клонирование предполагает получ ением б ольш ого ч исла копий ф рагментов Д Н К , идентич ны х исходному.

3. Г енетич еская трансф ормация , т.е. перенос и вклю ч ение генетич е- ских векторов (рекД Н К) в клетки-миш ени хоз я ина(реципиента).

4. М олекуля рная селекция – отб ор клонов, несущ их рекД Н К , ч то осущ ествля етс я с ис пользованием раз лич ны х маркерны х генов, которы е находя тся в векторной молекуленаряду с трансгеном.

5. В ы ращ ивание из мененны х клеток в целы е трансгенны е организ - мы . Расс мотрим подроб неенекоторы еиз этих процедур.

1.3.1.1. Понят и е овект оре. Ти п ы вект оров, и хконст руи ровани е

О б я зательной генетич еской конструкцией , использ уемой в экс периментах по генной инженерии, я вляется вект ор . Вект ор ы – э то молекулы Д Н К, способ ны еперенос ить вклю ч енны ев них ч ужеродны егены в клетку, гдеэ ти молекулы реплицирую тс я автономно или после интеграции с геномом (хромосомой ). Т.е. векторы использую тся в генной инженерии для переносатрансгенаоторганиз ма-донорав организм-реципиент, атакже для клонирования генов. П оч ему нельз я ввести ч ужеродны й ф рагмент Д Н К