5. Лабораторные методы выявления патогенных факторов у возбудителя колибактериоза

5.1. Идентификация энтеротоксигенных E.coli

Тест Бикена. Он пригоден для идентификации E.coli, синтезирующих ТЛ-энтеротоксин. Для постановки теста испытуемые изоляты E.coli выращивают на обычной питательной среде и затем в форме бляшек наносят на специальную агаровую среду Бикена, разлитую в чашки Петри. Агаровая среда состоит из 2 г гидролизата казеина, 1 г дрожжевого экстракта, 0,25 г NaCl, 1,5 г К2НРО4, 0,5 г глюкозы, 0,05 мл смеси микроэлементов и дистиллированной воды до 100 мл. Величину рН среды доводят до 7,5. В состав смеси микроэлементов входит 5 г MgSO-i, 2 г СаСЬ'бНгО, 0,5 г FeCb и 100 мл дистиллированной воды. Для усиления продукции ТЛ-энтеротоксина изолятами E.coli в чашки Петри после остывания питательной среды до 50-60°С вносят поО,5 мл раствора линкомицина (концентрация линкомицина в растворе - 2,7 мг/мл).

Идентифицируемые изоляты E.coli наносят в чашки Петри со средой Бикена по кругу на расстоянии около 4 мм от центра чашки и инкубируют при 37°С в течение 48 ч. Затем в центре чашки Петри в питательном агаре делают лунку, а выросшие в ней 4-5 бактериальных колонии покрывают бумажными дисками, пропитанными полимиксином В (500ЕД/диск), способствующим выходу ТЛ-энтсротоксина из бактериальных клеток, и снова инкубируют при 37ºС в течение 5-6 ч. После этого в лунку вносят 20 мкгсыворотки с антителами против ТЛ-энтеротоксина E.coli.

Учет результатов проводят через 24 и 48 ч после внесения в лунку специфической иммунной сыворотки. Если изоляты E.coli продуцируют ТЛ-энтеротоксин, то между исследуемыми бактериальными колониями и лункой со специфической сывороткой образуется четкая линия преципитации.

Другие тесты для идентификации изолятов E.coli, синтезирующих ТЛ-энтеротоксин: твердофазный радиоиммунологический метод, ганг-лиозид-иммуноферментный метод с применением иммуносорбента, пробы на культурах клеток опухоли надпочечника мышей (клеточная линия Y) и яичника китайского хомячка.

Кишечная проба на мышах сосунках. Тест пригоден для идентификации E.coli, синтезирующих ТС-энтеротоксин. Испытуемые изоляты E.coli рассеивают на чашки Петри с мясопептонным агаром для получения изолированных колоний и затем засевают их в бактериологические пробирки с бульоном Хоттингера (рН 7,2-7,4). Полученные суточные бульонные культуры или ее 48-часовую надосадочную жидкость испытывают на мышах-сосунках.

Для опыта берут 2-4-дн. мышей-сосунков и в течение 18-20 ч при температуре 25'С выдерживают на голодной диете. Отобранных для опыта животных слегка обогревают настольной электрической лампой. Для анального введения 0,1-0,2 мл (в зависимости от массы сосунка) выращенной бульонной культуры или культуральной надосадочной жидкости применяют туберкулиновый шприце иголкой для подкожных инъекций, на конец которой напаяна олива - утолщение диаметром 0,4-0,6 мм, предотвращающая травму кишки. Иглу вводят в анальное отверстие на глубину 3-5 мм. Материал вводят медленно, равномерно. При правильном введении пузырьки газа, имеющиеся в кишечнике, начинают двигаться по направлению к желудку, а рельеф петель кишечника, заполненного жидкостью, становится четко видимым через стенку живота. Правильность введения материала и отсутствие травмы определяют также при вскрытии.

После введения материала группу животных (3-5 мышек) выдерживают 4 ч в стеклянных банках, на дно которых положен слой бумаги. Через 4 ч после заражения проводят вскрытие опытных и контрольных мышей-сосунков. Животных, погибших в течение первого часа после заражения, исключают из опыта. Мышей, павших после этого срока, вскрывают сразу после их гибели.

Одной группе контрольных мышей-сосунков вводили стерильный бульон в том же объеме, другой - суточную бульонную культуру эталонного штамма E.coli, продуцирующего ТС-энтеротоксин.

Опытных и контрольных мышей вскрывают, отрезают тонкую кишку и переносят в полиэтиленовый мешочек, масса которого заранее извест­на. Отдельно определяют массу кишки и массу оставшейся части тушки. Затем сумму масс тонких кишок от данной группы мышей (3-5 животных) делят на сумму масс соответствующих тушек, получая среднюю арифметическую показателя расширения тонкой кишки. За положительный результат принимают показатель, превышающий 0,9.

Из других методов идентификации E.coli, синтезирующих ТС-энтеротоксин, может быть использована проба на мышах-сосунках по A.dean etal.

Тест на отек мышиной лапы. Он позволяет идентифицировать энтеротоксигенные E.coli, синтезирующие ТЛ- или ТС-энтеротоксины. В опыт берут беспородных белых мышей живой массой 12-14 г. В подушечку правой лапы вводят разрушенный ультразвуком лизат агаровой или бульонной культуры E.coli в объеме 0,05 мл, левая лапа служит контролем (в нее вводят изотонический раствор NaCI, бульон Хоттингера или бычий сывороточный альбумин). Бактериальный лизат получают из суспензии идентифицируемого изолята E.coli с исходной концентрацией 10¹⁰ клеток в 1 мл. На каждое исследование в опыте используют по 3-5 животных. Отек лап учитывают через 48 ч. Для этого задние конечности ампутируют по голеностопному суставу и взвешивают на торзионных весах. Величину отека определяют по разнице массы правой и левой лапы каждой мыши (в миллиграммах), затем рассчитывают среднюю арифметическую величину отека и ее доверительный интервал при Р-0,005. Обычно за положительный принимают показатель отека, равный 65 мг и более.

Тест отека лапы мыши - простая, чувствительная и легко воспроизводимая модель, позволяющая идентифицировать E.coli, синтезирующие ТЛ- и ТС-энтеротоксины вместе или по отдельности.

Другие методы идентификации энтеротоксигенных E.coli по ТЛ- и ТС-энтеротоксинам: лигированные участки тонкой кишки теленка, кролика, поросенка или белой мыши, кишечная проба на инфантильных кроликах. Экспериментальные модели с лиги рованными участками тонкой кишки для оценки биологической активности энтеротоксигенных E.coli трудоемки, требуют большого количества животных, плохо воспроизводимы, что связано с различной чувствительностью отдельных особей, а при параллельном испытании другими методами дают противоречивые результаты.

Реакция агглютинации для выявления антигенов адгезии у энтеротоксигенных E.coli. Для ее постановки необходимы высокоспецифические сорбированные агглютинирующие сыворотки против анти­генов адгезии и испытуемые культуры E.coli, выращенные на питательной среде, наиболее подходящей для синтеза антигенов адгезии.

Реакцию агглютинации ставят на предметных стеклах, на которые наносят отдельно одну каплю живой или формалинизированной культуры E.coli, выращенной при 18°С (отрицательный контроль). В обе капли вносят моноспецифическую противоадгезивную сыворотку. При положительном результате бактериальная культура, выращенная при 37°С, дает четкую реакцию агглютинации, а культура, выращенная при 18°С, будет инагглютинабельна. В реакции агглютинации адгезивный антиген К99 обнаруживают только в бактериальной культуре, полученной при посеве патологического материала непосредственно на среду Минка.

Выявлять антигены адгезии у энтеротоксигенных E.coli можно реакцией иммуноадгезивной гемагглютинацин, методом флюоресцирующих антител, реакциями агглютинации латекса, иммунной сорбции антител, меченых ферментом, и коагглютинацией, а также пробами на эпителиальных клетках кишечника, трахеи и пищевода теленка. Метод флюоресцирующих антител более чувствителен, чем реакция серологической агглютинации. Реакция агглютинации латекса по чувствительности и специфичности превосходит серологическую реакцию агглютинации и иммуноферментный метод.

5.2. Идентификация энтероинвазивных E.coli

Глазная проба на морской свинке. Идентифицируемый.изолят E.coli выращивают на агаровой питательной среде, затем на физиологическом растворе, из нее готовят суспензию с содержанием 10⁸-10¹⁰ клеток в 1 мл. Такую бактериальную суспензию по одной капле или по 0,05 мл вносят в конъюнктивальный мешок глаза морской свинки (опыт), в другой - физиологический раствор (контроль). Через 24 ч проводят клиническое исследование конъюнктивы обоих глаз морской свинки. При наличии признаков кератоконъюнктивита (покраснение слизистой оболочки глаза, истечение из глаза серозной жидкости) идентифицируемый изолят E.coli относят к энтероинвазивному. Глаз, на слизистую которого нанесен физиологический раствор, рекомендуют исследовать ежедневно в течение трех суток.

Глазная проба на белой мыши. Для опыта берут белых мышей в возрасте 6 нед. В один конъюнктивальный мешок вводят идентифицируемую культур E.coli в дозе 1.10 -5.10⁸, в другой - стерильный физи­ологический раствор (контроль). Через 18-24 ч проводят клиническое исследование конъюнктивальных мешков обоих глаз. Энтероинвазивные E.coli у белых мышей вызывают конъюнктивит. Спустя 3-7 дн. белые мыши выздоравливают. Результаты-обнаружения энтероинвазивных E.coli по глазной пробе, поставленной на разных лабораторных животных, как правило, коррелируют.

Энтсроинвазивныс E.coli можно идентифицировать пробой на культуре клеток опухоли гортани человека (клеточная линия Нер-2) и другими методами.

5.3. Идентификация энтеропатогенных E.coli

Культура клеток Нер-2. Клетки Нер-2 культивируют в чашках Петри с покровными стеклами при температуре 37ºС в течение 3 дн. Идентифицируемые изоляты E.coli в стационарных условиях выращивают в пептонной воде с содержанием в ней 1 % D-маннозы в течение 18-24 ч при 37ºС. Выращенные бактериальные культуры разбавляют" до содержания в 1 мл 10⁷-10⁸ клеток. В качестве разбавителя используют ростовую среду Игла (1:50) без антибиотиков, но с наличием в ней 1 % D-маннозы.

Культуру клеток Нер-2 перед выявлением на ней адгезивных свойств E.coli два раза промывают средой Игла, сбалансированной солями. Бактериальную культуру в объеме 1 мл добавляют в чашки Петри с клетками Нер-2 и инкубируют при температуре 37ºС в течение Зч. После этого клетки Нер-2 снова промывают средой Игла, фиксируют в метаноле и обрабатывают краской Гимза. Полученные препараты исследуют под микроскопом с увеличением в 1000. Изоляты E.coli считают энтеропатогенными, если 40% и более клеток Нер-2 имеют по 10 и более прикрепленных к ним бактерий.

Проба на культуре клеток африканской зеленой обезьяны (клеточная линия Уего). Тест основан на способности энтеропатогенных E.coli продуцировать цитотоксин, который разрушает монослой клеток Vero.

Для культивирования клеток используют ростовую среду 199 с солевыми компонентами среды Игла, в которую из расчета на 100 мл добавляют 10 мл сыворотки крови плода крупного рогатого скота, 2 мл раствора пенициллина со стрептомицином (5 тыс. ЕД/мл), 0,5 мл глютамина и амфотерцина В в количестве 250 мкг/мл среды. Для промывания клеток Vero применяют фосфатно-буфсрную среду Дульбекко и Фогта без солей кальция и магния.

Культуру клеток Vero выращивают при температуре 37ºС в течение 7дн., обрабатывают трипсином и затем на свежей ростовой среде готовят из нее суспензию с концентрацией 5^х10⁴ клеток/мл.

Приготовленную клеточную суспензию в объеме по 0,2 мл вносят в лунки плато, помещают в специальную чашку, которую закрывают крышкой и заклеивают пленкой. Плато с клеточной суспензией 3 дн. инкубируют при температуре 37°С.

Идентифицируемые изоляты E.coli выращивают в жидкой питательной среде (МПБ, триптиказ-соевый бульон и др.) при 37ºС в течение 18-20 ч и затем фильтруют через мембраны с диаметром пор 0,45 мкм. Нативные и прогретые при 100° в течение 15 мин. фильтраты испытуемых E.coli в объемах по 0,2 мл добавляют в лунки с выращенной культурой клеток.

Плато, в лунках которого находятся клетки Vero и материал идентифицируемых E.coli, снова помещают в чашки, заклеивают специальной пленкой и инкубируют при температуре 37°С в течение 4 дн. Посте этого клетки Vero фиксируют метанолом (5 мин) и окрашивают 5%-ним раствором краски Гнмза (45 мин). Окрашенный монослон клеток Vero промывают дистиллированной водой, высушивают и исследуют под микроскопом. Если идентифицируемые изоляты E.coli продуцируют цитотоксин, то нарушается целостность монослоя культуры клеток, при отсутствии в исследуемом материале цитотоксина монослой клеток остается цельным.

Культура клеточной линии Vero также чувствительна к ТЛ-энтеротоксину E.coli. Если такой токсин содержится в исследуемом материале, то клетки Vero округляются и частично отделяются одна от другой (в лунках с прогретым фильтратом бактериальных культур такие изменения отсутствуют).

5.4. Идентификация септических E.coli

Определение синтеза гидроксамата. При определении синтеза гидр-ксамата изоляты Е.соИ выращивают на питательной среде следующего состава: в 1 л дистиллированной воды растворяют 6 г N32HPO4, 3 г КН2РО4, 0,5 г NaCl и 1 г NaH4Cl. После автоклавирования в среду из расчета на 100 мл и с соблюдением условий стерильности добавляют 1 мл 0,01М СаСl, 0,1 мл 1М MgSO4x7H2O, 1 мл 20%-ного раствора глюкозы, 5 мл 10%-ного раствора кислотного гидролиза пептона Дифко. Перед добавлением эти ингредиенты стерилизуют фильтрованием. Бактериальную культуру в стационарной фазе центрифугируют, из расчета на I мл полученного центрифугата добавляют 1 мл ЗМ H₂SO₄ и выдерживают при температуре 120ºС в течение 4 ч. После охлаждения в бактериальную суспензию, гидролизованную серной кислотой, добавляют 1,55 мл 35%-ного раствора CH₃OONa и 1 %-ного раствора сульфа-ниликовой кислоты, приготовленной в 30%-ном растворе уксусной кислоты, 1 мл 1,3%-ного раствора йодистоводородной кислоты, приготовленной в ледяной (кристаллизованной) уксусной кислоте, и выдерживают в темном месте в течение 5 мин. После этого в полученную смесь добавляют по 1 мл 2%-ного раствора арсената натрия и 3%-ного oi-нафталамил, приготовленного в 30%-ной уксусной кислоте, и оставляют в темном месте на 30 мин.

Учет результатов: если идентифицируемый изолят E.coli синтезирует гидроксамат, то бактериальная суспензия окрашивается в красный цвет.

Определение вирулентности. Определение вирулентности септических E.coli проводят по измерению среднем летальной дозы, при которой гибнет 50% инфицированных лабораторных животных (белые мыши, морские спинки и др.). Исследуемый изолят E.coli выращивают на питательной среде при температуре 37ºС в течение 18-20 ч в шуттель-аппарате. Затем готовят бактериальную суспензию (если E.coli выращивали на агаровой питательной среде) в концентрации, равной концентрации клеток 18-20-часовой бульонной культуры, и делают последовательные 10-кратные разведения или любые другие последовательно увеличивающиеся разведения.

Белых мышей массой 12-14 г внутрибрюшинно заражают бактериальной суспензией четырех последовательных разведений. Обычно на каждое разведение берут 2-10 белых мышей.

LD₅₀ E.coli, возбудителей септической формы колибактериоза телят, составляет не выше 10 бактериальных клеток, несептических — более 10⁸ клеток.

Определение устойчивости E.coli к бактерицидной активности сыворотки крови. Параллельное свежую сыворотку крови кролика и фосфатно-солевой буфер (ФСБ) добавляют исследуемый изолят E.coli в логарифмической фазе роста (10 бактериальных клеток в 1 мл сыворотки или ФСБ) и инкубируют при 37ºС. Через 1, 2, 3 ч инкубации подсчи­тывают число живых клеток E.coli в сыворотке и ФСБ.

Исследуемые изоляты E.coli считают устойчивыми, если их число в пробах сыворотки крови увеличивается, промежуточно-устойчивыми если их число остается тем же, и чувствительными если их число снижается.

Для идентификации септических E.coli могут быть использованы метод выявления колицинов и определение адгезивных свойств [8 ].