- •Эмбриональные стволовые клетки:
- •Глава 2 Стволовые клетки в эмбриогенезе мозга млекопитающих
- •Эмбриональные стволовые клетки: фундаментальные исследования
- •1. На пороге новой биологии и медицины
- •2. Эск: основные определения и концепция
- •3. Основные источники и способы выделения эск
- •4. Молекулярные основы тотипотентности генома эск
- •5. Особенности фенотипа эск
- •7. Направленная дифференцировка эск и ппк in vitro
- •8. Эск в изучении функций Нох-генов
- •10. Эск: законодательство и биоэтика
- •11. Мост между наукой и клиникой
- •12. Литература
- •1. Модели на стыке клеточной биологии и геномики
- •2. Нервная трубка - первоисточник провизорных стволовых клеток
- •3. Стволовое пространство обонятельного нейроэпителия
- •4. Стволовое пространство эпендимы
- •5. Клональная дисперсия стволовых клеток мозга
- •6. Регионализация и сегментация нервной трубки
- •7. Первичный нейро - и глиогенез
- •8. Направленная миграция прогениторных клеток: взаимодействие с радиальной глией
- •9. Нейрональные стволовые клетки in vitro
- •10. Методические трудности получения клонов нск из эск
- •11. Получение нейронов из эск
- •12. Получение линий нск
- •13. Трансплантация нск/прогениторных клеток в развивающийся мозг эмбрионов
- •14. Трансдифференцировка нск после трансплантации
- •15. Нейромезенхимальные стволовые клетки нервного гребня
- •16. Литература
10. Методические трудности получения клонов нск из эск
В зародыше весь пул НСК нервной трубки образован механизмом нейрональной индукции из эктодермы. Первые нестин+ НСК в нервной трубке возникали у зародышей мыши 7,5 дня развития. Подобно эпибласту, нервная трубка - это уникальная плюрипотентная ткань, где числом формирующихся клонов НСК реализуется трехмерный проект мозга. На уровне первичных клонов пролиферация определяется превалированием сигналов noggin, SHH над BMP-4 и BMP-7 механизмом “дефолта”. Дефолт в развитии –это автоматическая программа активации клеток после устранения ингибиторов (TGF-beta) ( Tropepe V., Hitoshi S., Sirard C. et al., 2001). Эти авторы наблюдали частичную трансформацию ЭСК в НСК в редкой культуре без фидера и сыворотки. Существенно, что ЭСК при этом переходе не подвергались предварительной модификации в клетки первичной эктодермы. Присутствие фидерного мезенхимального слоя сдвигало баланс сигналов в пользу других производных эктодермы (эпидермис кожи). Факторы сыворотки также чаще всего блокировали нейрогенез из ЭСК. Из отдельных клеток формировались клоны НСК с промежуточным фенотипом между ЭСК и нейросферами, выделяемыми из концевого мозга новорожденных животных. Единичные самообновляющиеся клоны НСК возникали при плотности 20 ЭСК/мкл и 1000 ед LIF. Другие добавки (B27 supplement, EGF, bFGF) без LIF не индуцировали образование клонов НСК. Этот путь получения нейросфер нерентабелен из-за малой доли (0,2 - 0,4%) образующихся колоний НСК. Показательно, что спектры мРНК исходных ЭСК и колоний НСК не претерпевали существенных изменений, кроме исчезновения мРНК Oct4. В клонах сохранены мРНК всех генов трех зародышевых листков и ранних master-genes рестрикционного созревания клеточных линий. Плюрипотентность клонов НСК позволяла активно химеризовать ткани зародыша-реципиента после имплантации в морулу. С этой целью были получены нейросферы, стабильно меченые цветными белками. Пересаженные НСК активно мигрировали, пролиферировали как в головном мозге, так и других органах зародыша ( Tropepe V., Hitoshi S., Sirard C. et al., 2001). В противоположность НСК зародыша, НСК из мозга взрослых животных, теряли способность к химеризации зародышей ( Clarke D.L., Johansson C.B., Wilbertz J. Et al.,2000).
Судьба изолированных ЭСК зависела в основном от эпигеномных синалов (noggin, notch, cerebrus, LIF, ВМР-4, ВМР-7). В культуре удалось понять причину блокировки нейрогенеза при высоких плотностях ЭСК - мешают меклеточные взаимодействия между слоями прогениторных клеток. Процент нестин+ клеток снижался на 75-85% в плотных культурах эмбриоидных телец. Многие авторы подтвердили, что в культуре ЭСК проще наладить получение нейронов, глии ( более сложно получить олигодендроциты), чем превратить эмбриоидные тельца в нейросферы ( Okabe S., Forssberg-Nilsson K., Spiro A.C. et al., 1996; Brustle O., Jones K.N, Learish R.D. et al.,1999; Finley M.F.A.,Devata S.,Huettner J.E.,1999). Как известно, пересадки пролиферирующих тотипотентных ЭСК в мозг не практикуются из-за риска малигнизации части клеток. Однако фракцию эмбриоидных телец с дифференцирующимися нейронами удавалось пересаживать в мозг животных без осложнений. После пересадки в мозг часть клеток трансформировалась в нестин+ популяции клеток ( Benniger Y., Marino S., Hardegger R. et al., 2000).