13. Трансплантация нск/прогениторных клеток в развивающийся мозг эмбрионов

Лабораторно полученные высокоочишенные прогениторные клетки использовали для пересадки в развивающийся мозг мышей и других лабораторных млекопитающих. Сперва клетки линии ЭСК наращивали до больших плотностей над фидером в среде ДМЕМ-20% FCS + 1000 U LIF/мл. Для получения эмбриоидных агрегатов клетки переносили на чашки, покрытиые желатиной, а также убирали LIF из среды. Через 4 дня меняли на селективную среду пролиферации (ДМЕМ/F12 + 5мкг/мл инсулина, 30 нм селениум хлорида, 5 мкг/мл фибронектина. За 72 в селективной среде пролиферации 80% клеток погибало. Среди оставшихся выживших клеток более 80% были нестин+ веретеновидные прикрепившиеся клетки. Эти клетки прокрашивались антителами к кератину 8 и поверхностному антигену SSEA-1 (Brustle O., Spiro C., Karram K. et al.,1997). После инъекции очищенных прогениторных клеток человека в телэнцефалические пузырьки мозга зародыша крысы 15-20 дня гестации наблюдали массированную миграцию пересаженных клеток по всем растащим областям мозга. Наибольшая доля клеток мигрировала из желудочков в серое вещество коры ,corpus collosum, cтриатум, гипоталамус, гиппокамп, обонятельную луковицу, где дифференцировались в нейроны и астроглию. Позднее всех появлялись олигодендроциты ( если вводить трансплантат на поздних сроках развития плодов). Часть пересаженных клеток оставалась в эпендиме желудочков, где формировались кластеры донорских клеток в монослое эпендимы. Хотя пересаженные прогениторные клетки содержали примесь типичных ЭСК, ни в одном случае не наблюдали образования тератокарцином. Результаты показали, что с помощью повторных пересадок можно достичь высокой доли химеризации мозга крыс.

14. Трансдифференцировка нск после трансплантации

В этом разделе упомянем лишь корректно выполненные работы, содержащие безукоризненные доказательства трансформации НСК в соматические клетки вне ЦНС и ПНС. Первая работа Bjernson , выполненная с клетками, мечеными геном микробной бета-галактозидазы, верифицировала появление донорских меченых клонов гематогенных клеток в костном мозге облученных мышей ( Bjornson C.R., RietzeR.L., Reynolds B.A. et al.,1999). Позднее у тех же мышей донорские клоны гематогенных клеток были изолированы из селезенки и кровотока методом поточной цитофлуориметрии. В следующей работе была продемонстрирована возможность количественной химеризации скелетных мышц конечностей с помощью пересадок НСК мыши и человека в мышцы животного

( Galli R., Borello U., Gritti A. et al., 2000). Меченые геном бета-галактозидазы НСК , изолированные из эпендимы мозга взрослых животных, после инъекции в бластоцисты мыши давали ростки донорской соматической ткани в скелетной и сердечной мышце, кишечнике, мозге, коже, но не в кроветворной системе костного мозга ( Clarke D.L., Johanssen C.B.,Wilbertz J. et al, 2000). Эти особенности колонизации разных органов могли быть связаны с фракцией НСК из эпендимы. В последующих исследованиях приведены убедительные доказательсва гетерогенности НСК, полученных одновременно из эпендимы/субэпендимы ( Rietze R.L., Vacanis H., Bresker G.F. et al., 2001). Изолированные популяции имели гетерогенный фенотип. 80% клеток формировали клоны ( нейросферы). Эта работа подтвердила полученные ранее данные о высокой морфологической и иммунофенотипической гетерогенности НСК , выделенных из тех же отделов мозга фетусов. Природа выявляемой гетерогенности пока не имеет достаточно аргументированных объяснений.