Preparaty_-_proizvodnye_tsiklopentanpergidrofenantrena__1

R - С2Н5,	4 = норгестрел
R - СН3,	4, 3-дезоксо = линоэстренол
	3.3. Кортикостероиды

Гидрокортизон

Для поизводных гидрокортизона характерно:

–для проявления глюкокортикоидной активности необходимо наличие в 17α- и 11β-положениях гидроксильных групп;

–у 11-эпипроизводных кортикостероидов резко снижена глюкокортикоидная активность;

–наличие в 9α-положении атома фтора увеличивает глюкокортикоидную активность в 10 раз;

–синтетические аналоги глюкокортикоидов, характеризующиеся высокой физиологической активностью, имеют дополнительную двойную

связь в C1,2-положении (преднизолон), атом фтора в 9α-, a иногда 6αположении и заместитель (метил-, гидроксил- и др.) в С16-положении (дексаметазон, бетаметазон, триамцинолон и др.);

–изменение субдоминантной группы гидрокортизона ацетата, а именно конденсация кольца А в положение 2,3 с фенил-пиразолом, приводит к получению высокоэффективного препарата – кортивазола или его деацилированного производного, обладающего мощным противовоспалительным действием и высоким сродством к специфическим рецепторам (в 40 раз выше чем у дексаметазона).

Структурная формула синтетического глюкокортикоида – кортивазола

11

–16α,17α-диоксикортикостероиды используют в форме циклических кеталей, образующихся в результате взаимодействия с ацетоном или другими кетонами (флюоцинолона ацетонид, триамцинолона ацетонид, будесонид); данная модификация приводит к снижению всасываемости препаратов, которые применяются местно в виде мазей или кремов;

–как природные, так и синтетические кортикостероиды часто применяют в виде сложных эфиров, в основном по С21-гидроксигруппе, а иногда

ипо С17- и С16-гидроксигруппам; особенно важны водорастворимые натриевые соли их 21-фосфатов (дексаметазона натрия фосфат) и 21-сукци- натов (преднизолона гемисукцинат);

–водорастворимые формы глюкокортикоидов можно получить замещением 21-гидроксигруппы на аминопроизводные, например N-метил-N’- пиперазинил-преднизолона гидрохлорид;

–для некоторых глюкокортикоидов (гидрокортизон, преднизолон, дексаметазон) исследуется возможность использования в форме водорастворимых полимерных производных с целью коррекции их фармакологических и токсических эффектов. Известны полимерные производные гидрокортизона и преднизолона на основе образования полиэфиров в результате реакции ацелирования с сополимером поливинилпирролидона и малеинового ангидрида;

–комплекс флюоцинолона ацетонида с Р-циклодекстрином является основой мази «Синафлан-ЦД», подобная модификация молекулы приводит

кповышению фармакологической активности в 1,5–2 раза по сравнению с прототипом.

3.4.Эстрогены

Эстрадиол

Для производных эстрадиола характерно:

12

–для проявления эстрогенной активности необходимо наличие ароматического кольца А и свободной 3β-гидроксигруппы;

–у эстрона (17-кетопроизводное) биологическая активность в 5–15 раз ниже эстрадиола;

–у 17-эпипроизводного эстрадиола (α-эстрадиол) эстрогенная активность снижена в 20 раз;

–наличие в 16α-положении эстрадиола гидроксильной группы снижает его эстрогенное действие, а введение 16β-гидроксигруппы приводит к полной потере биологической активности; 16-гидроксиэстрадиол («Овестин») применяется для лечения состояний и симптомов, связанных с дефицитом эстрогенов (хирургическая или естественная менопауза);

–введение в 17α-положение эстрадиола этинильного радикала приводит к усилению эстрогенной активности и устойчивости при пероральном применении (этинилэстрадиол); этинилэстрадиол и его 3-метоксипроиз- водное – местранол – являются эстрогенными составляющими всех пероральных контрацептивных препаратов;

–11-арилпроизводные этинилэстрадиола обладают антигестагенной активностью (абортирующие контрацептивные препараты – «Мефипристон», «Пенткрофтан»).

4.СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ

4.1. Химический синтез стероидных гормонов

Исследования в области полного химического синтеза стероидов начались в 1932 году после установления структуры холестерина. За короткий период так называемой «стероидной лихорадки» с 1932 по 1960 гг. были синтезированы практически все природные стероидные гормоны – эстрон (Мишер, 1948 г.), андростерон, холестерин, кортизол (группы Робинсона и Вудворда, 1951 г.). Полный синтез стероидов позволил полностью подтвердить их химическую структуру, а также явился мощным толчком развития органического синтеза вообще. С 60-х годов исследователи стали стремиться к разработке полного синтеза гормонов, пригодного для осуществления малостадийного, стереоспецифического промышленного синтеза. Впервые данная задача была решена для синтеза эстрона из дешевого сырья – перолина – за 8 химических стадий с выходом 27 %.

Основные трудности полного синтеза стероидов заключаются:

– в наличии 4 углеродных циклов, конденсированных в о-положе-

ниях;

13

–в обеспечении пространственного строения синтезируемой молеку-

лы (холестерин содержит 8 асимметрических атомов углерода, что делает возможным существование 28 = 256 стереоизомеров);

–в разработке стереонаправленных процессов, позволяющих на каждой стадии синтеза получать нужные стереоизомеры.

В настоящее время полный химический синтез стероидов, как правило, не имеет практического значения. Для получения лекарственных препаратов стероидных гормонов используют полусинтез из природных (растительных и животных) стеринов с применением методов химической и микробиологической трансформации молекулы.

Основные реакции, используемые в синтезе стероидных гормонов и их полусинтетических производных, будут рассмотрены на примере синтеза эстрогенных гормонов и кортикостероидов.

Промышленный синтез эстрона основан на гидрировании 2-метокси- нафталина до тетралина, окислением которого хромовой кислотой до тетралона и обработкой винилмагнийбромидом получают спирт.

2-Метилциклопентандион-1,3 как СН-кислота легко присоединяется по винильной группе спирта, образуя после дегидратации щелочью соединение, которое далее подвергают кислотнокатализируемой циклизации с отщеплением одной молекулы воды. В результате возникает конденсиро-

ванный четырехъядерный остов молекулы. Гидрированием (H2/Pd) олефиновой связи с последующим гидролизом метоксильной группы получают эстрон.

Из эстрона присоединением ацетилена синтезируют этинилэстрадиол

иместранол. Введение метальных и этинильных групп в 17α-положение может осуществляться другими методами:

–с помощью магнийорганических реактивов Гриньяра по схеме:

14

–синтез Реппе:

–синтез Фаворского:

Кортикостероидные гормоны – гидрокортизон, кортизона ацетат и др. – получают из природных соединений – холестерина или стероидных сапонинов (диосгенин, тигогенин) и стероидных алкалоидов (саласодин).

Сначала холестерин окислительным отщеплением боковой алкильной группы при С17 хромовым ангидридом (после предварительной защиты гидроксильных и -С=С- групп соответственно ацилированием и бромированием) переводят в дибромкетон. Этот кетон дебромируют действием цинка и получают ацетат дегидроэпиандростерона, в котором кольцо D химически модифицируют. После цианирования и дегидратации получают цианопроизводное, обработка которого метилмагнийбромидом дает промежуточный имин, легко гидролизуемый добавлением водой, что позволяет преобразовать цианогруппу в ацетильную и снять ацетильную защиту с ОН-группы

при С3.

Спиртовую группу в кольце А оксирана превращают в оксогруппу по Оппенауэру. Реакция идет в присутствии изопропилата алюминия и циклогексанона (акцептор водорода) и сопровождается изомеризацией двойной связи из кольца В в кольцо А, что приводит к сопряженному енону.

Трансформацию 5-3β-окси-стероидов в 4-3-кетоны можно осуществить и другими методами:

– в реакции Веттштайна, разновидности реакции Оппенауэра, вместо циклогексанона используется бензохинон, что приводит к образованию 4,6- 3-кетопроизводных;

–реакция Пфицнера – Маффета проводится в более мягких условиях

вприсутствии дициклокарбодиимида в растворе ДМСО при температуре

20 °С.

На следующей стадии оксирановое кольцо в соединении расщепляют действием НВr. Полученное производное дебромируют до третичного спирта, который окисляют до кетодиола – кортексолона.

15

Решающей стадией синтеза кортикостероидных гормонов является селективное биогидроксилирование кортексолона по С11 с использованием культуры бактерий Rhizopus nigricans. Полученный триол окисляют до гидрокортизона, который ацетилируют с образованием эфира.

Введение ацилированных α-кетольных групп в 17β-положение глюкокортикоидов может осуществляться и в условиях реакции Арндта – Айстерта разложением диазокетонов:

Химическая трансформация основных сырьевых полупродуктов в синтезе кортикостероидов и гестагенов – стероидных сапонинов и стероидных алкалоидов – проводится в три стадии с получением ацетата 16-деги- дропрегненолона, который является основой для синтеза всех кортикостероидов.

Схема получения ацетата 16-дегидропрегненолона

4.2. Микробиологическая трансформация стероидов

Первые сообщения о трансформации стероидов микроорганизмами появились задолго до того, как было выяснено строение стероидов. Еще в конце прошлого столетия было установлено, что бактериальная флора кишечника млекопитающих способна превращать холестерин в копростерин, а холевую кислоту – в дезоксихолевую.

16

В1908 году была обнаружена способность бактерий Escherichia coli окислять гидроксильные группы холевой кислоты. В 1937 году было открыто восстановление дрожжами 17-кетогрупп и осуществлено превращение эстрона в эстрадиол. В 1952 году получено 11α-оксипроизводное прогестерона при его ферментации с плесенью Rhizopus nigricans.

Врезультате исследований с 1934 по 1954 годы химия стероидов получила новый, чрезвычайно эффективный метод синтеза, отличающийся высокой специфичностью и приводящий во многих случаях к высоким выходам таких соединений, которые трудно получить химическим путем. За этот период открыто около 100 реакций трансформации стероидов с участием около 60 видов микроорганизмов. За последние годы исследований в этом направлении число реакций увеличилось в 60 раз, а число используемых для этих целей микроорганизмов – в 18 раз.

Сиспользованием микроорганизмов можно осуществлять следующие типы превращений:

–образование и расщепление углеродных связей;

–образование и восстановление двойных углеродных связей;

–изомеризация двойных углеродных связей;

–гидроксилирование и дегидратации;

–образование и раскрытие α-окисей;

–гидролиз и этерификация;

–образование и восстановление кетогрупп;

–образование и разрушение связей галоген-углерод;

–образование и разрушение связей азот-углерод;

–образование и разрушение связей сера-углерод;

–расщепление рацематов стероидов, полученных химическим синте-

зом.

Вкачестве сырья для промышленных процессов трансформации стероидов используются природные стерины, выделенные из растительных источников (стероидные сапонины и алкалоиды) и различных органов животных (ситостерины, холестерин и др.). Микробиологический синтез всегда сочетается с химическими превращениями молекулы стероидов.

Первоначально реакции микробиологической трансформации стероидов проводились с помощью неиммобилизованных клеток микроорганизмов в двухфазных водно-органических системах. Клетки при этом локализовались в водной фазе, а стероидные соединения – в органической. Кроме того, микроорганизмы подвергались губительному воздействию органического растворителя. Данный метод имел низкую эффективность и требовал постоянного возобновления трансформирующей культуры клеток микроорганизмов после каждого производственного цикла. Поэтому для трансформации стероидных гормонов в 1970 г. был впервые применен метод прове-

17

дения реакций с использованием иммобилизованных клеток микроорганизмов.

Иммобилизация клеток микроорганизмов осуществлялась путем включения их в различные гели (полиакриламидные гели, гели альгината, каррагинана, агара) или мембраны различных полимеров, а также адсорбции на целлюлозе, керамике, ионитах, силикагеле и др., а также путем ковалентного связывания с силикагелем. Иммобилизованные клетки микроорганизмов, находящиеся внутри гранул носителя в водной фазе, мало подвержены воздействию органических растворителей, не смешивающихся с водой. Например, в качестве катализатора реакции дегидрирования стероидов в среде бензола и гептана используются различные виды бактерий Nocardia sp., включенные в гидрофобные гели (уретановые полимеры). Они обладают высокой активностью и стабильностью, чем бактерии, находящиеся в гидрофильном окружении.

Использование иммобилизованных клеток микроорганизмов имеет множество преимуществ и перед иммобилизованными ферментами. Хорошо известно, что некоторые стероидтрансформирующие ферменты, особенно гидролазы и дегидрогеназы, являются весьма лабильными белками, их выделение и очистка затруднены, а закрепленные на нерастворимых материалах клетки микроорганизмов служат постоянным носителем активных стабильных полиферментных систем.

Основные реакции микробиологической трансформации стероидных соединений, используемые в промышленном синтезе стероидных гормонов, приведены в табл. 1.

Таблица 1

Микробиологическая трансформация стероидов, имеющая промышленное значение

	Реакция	Субстрат	Продукт	Микроорганизм
	11α-	Прогестерон	11α-гидроксипрогестерон	Rhizopus
	гидроксилирование			nigricans
	11β-	Вещества S	Гидрокортизон	Curvularia lunata
	гидроксилирование
	16α-	9α-	9α-фтор-16α-	Streptomyces
	гидроксилирование	фторкортизол	гидроксикортизон	roseochromogenus
	1,2-дигидрирование	Гидрокортизон	Преднизолон	Arthrobacter
				simplex
	Расщепление	β-Ситостерин	Андростадиендиол	Mycobacterium
	боковой цепи		Андростендион	sp.

Одной из важных реакций микробиологического синтеза стероидных гормонов является трансформация природных 5-3-оксисоединений (холе-

18

стерин, диосгенин, саласодин и др.) в 4-3-кетопроизводные, поскольку наличие 4-3-кетогруппы необходимо для проявления гормональной активности андрогенов, гестагенов и кортикостероидов. Так, например, тестостерон можно получить в две микробиологические стадии с выходом около 80 % по схеме:

Синтез гестагенов проводят путем превращения прегненолона в прогестерон в одну стадию со 100 % выходом основного продукта реакции, поэтому преимущество микробиологического процесса трансформации молекулы перед химическими методами (по Оппенауэру и др.) очевидно:

Молекулы кортикостероидов и их синтетических аналогов содержат несколько гидроксильных групп. Их введение химическими методами хорошо разработано лишь для гидроксигрупп, находящихся по соседству с -С=О или –С=С-группами. Но если вводимая гидроксигруппа не имеет такого окружения, то все химические методы становятся неэффективными. Это относится, прежде всего, к 11β- и 11α-гидроксигруппам. В современном производстве глюкокортикоидов введение данных групп проводят только с помощью микробиологической трансформации кортексолона, используя гидроксилирующие культуры – Rhizopus nigricans, Curvularia lunata, Tieghemella orchldis, Cunninghamella blakesleana, Trichothecium roseum и др.

19

Другой важной реакцией в синтезе физиологически активных анаболиков (метандростенолон) и кортикостероидов (преднизолон, дексаметазон и др.) является реакция микробиологического 1-дегидрирования.

В настоящее время разработаны различные способы интенсификации микробиологической трансформации стероидных гормонов:

– предварительное индуцирование растущей культуры-трансформа- тора соответствующим субстратом или его аналогом;

–использование нерастворимых микрокристаллических стероидных субстратов, полученных путем диспергирования и измельчения субстрата, а также превращением его в водорастворимое состояние с помощью β- циклодекстринов.

5. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ

Основные тенденции в современном фармакопейном анализе препаратов стероидных гормонов и их синтетических аналогов заключаются в повышении требований к избирательности метода. Возможности использования для этого новых химических реакций, селективных с классической точки зрения, практически исчерпаны. Новые перспективы открываются с использованием спектральных и хроматографических методов. При разработке избирательных методов анализа стероидных гормонов, пригодных для фармацевтического анализа, во внимание принимаются их чувствительность и продолжительность. При контроле субстанций стероидных гормонов эти требования не очень высоки, поэтому чаще всего используются методы спектрофотометрии в УФ- и видимой области спектра. Но в некоторых случаях, например, при анализе эстрогенов и гестагенов в контрацептивных препаратах, фторкортикостероидов в мазях, а также следовых

20