Preparaty_-_proizvodnye_tsiklopentanpergidrofenantrena__1

ализаринат циркония	ализариновый красный
красно-фиолетовый цвет	желтый цвет

Для идентификации флюоцинолона ацетонида ЕФ рекомендует использовать реакцию с хромовой смесью (раствор бихромата калия в концентрированной серной кислоте). При нагревании реакционной смеси на пламени горелки выделяются белые пары и стекло пробирки над жидкостью становится матовым. Реакция основана на образовании в результате минерализации препарата фтороводородной кислоты (HF), которая растворяет стекло.

17β-спиртовый гидроксил (метилтестостерон, метандриол) обнаруживают по реакции этерификации с уксусным ангидридом в присутствии безводного пиридина. Измеряют температуру плавления образующихся сложных эфиров (tпл метилтестостерона ацетата = 173–176 °С, tпл метандриола ацетата = 174–180 °С).

Лекарственные вещества, содержащие сложноэфирную группу (кортизона ацетат, дезоксикортона ацетат, эстрадиола дипропионат, тестостерона пропионат и др.), с гидроксиламином в щелочной среде образуют гидроксамовую кислоту, которая при добавлении раствора хлорида железа (III) окрашивается в вишнево-красный цвет.

Препараты, представляющие собой сложные эфиры, можно идентифицировать по продуктам щелочного гидролиза. Так, tпл тестостерона, полученного в результате гидролиза тестостерона пропионата, составляет 150–153 °С, a tпл эстрадиола, выделенного из эстрадиола дипропионата, – 173–179 °С.

ЕФ рекомендует использовать для идентификации лекарственных препаратов, представляющих собой эфиры уксусной кислоты (ципротерона ацетат, гидрокортизона ацетат, дезоксикортона ацетат и др.) реакцию с нитратом лантана и йодом. Субстанцию помещают в колбу, смешивают с 0,15 мл 85% раствора фосфорной кислоты, на колбу помещают предметное стекло, с которого свисает капля 5% раствора лантана нитрата и нагревают в течение 5 мин. Предметное стекло осторожно снимают, переворачивают и

41

после охлаждения последовательно добавляют по 1 капле 0,01 М раствора йода и раствора аммиака. Через 1–2 мин появляется синее окрашивание, обусловленное адсорбцией йода основным ацетатом лантана

([CH3COO]3La) 2J2 KJ.

Частные реакции препаратов стероидных гормонов

Стероидные гормоны вступают в следующие виды реакций:

–в ципротерона ацетате после сплавления карбонатом натрия обнаруживают хлорид-ион реакцией с нитратом серебра (ЕФ);

–к спиртовому раствору прогестерона добавляют щелочной раствор 1,3-динитробензола, появляется розовое окрашивание, постепенно переходящее в красно-коричневое (ГФ);

–2 мг этинилэстрадиола растворяют в 2 мл концентрированной серной кислоты, через 1–2 мин появляется оранжево-красное окрашивание с желто-зеленой флюоресценцией, добавляют 1 каплю раствора сульфата железа (III) аммония (квасцы железоаммониевые) и воды – раствор темнеет и через некоторое время образуется красновато-коричневый осадок (ГФ);

–тестостерона пропионат, этистерон (прегнин) и норэтистерон идентифицируют реакцией со спиртовым раствором бутилгидрокситолуола (2,6-ди-трет-бутил-n-крезол) в щелочной среде, при нагревании на водяной бане (t = 70–80 °С) в течение 30 мин. После охлаждения раствора до комнатной температуры тестостерона пропионат и этистерон (прегнин) образуют продукты реакции, окрашенные в интенсивный синий цвет, а норэтистерон – в желто-розовый (ЕФ).

5.2.Методы количественного анализа стероидных гормонов

всубстанциях и лекарственных формах

5.2.1. Титриметрические методы

Молекулы стероидных гормонов содержат ограниченное количество функциональных групп, которые можно было бы использовать для их титриметрического определения в субстанциях и лекарственных формах. Чаще всего количественный титриметрический анализ проводят по следующим группам:

– этинильной группе, используя ее способность образовывать двойные соли с нитратом серебра. Выделившееся эквивалентное количество азотной кислоты оттитровывают ОДМ раствором NaOH, точку эквивалентности определяют потенциометрически или с помощью индикатора бром крезолового синего (Мм эквивалента = Мм).

42

Данный метод включен в ЕФ для количественного определения этистерона, норэтистерона, левоноргестрела, этинилэстрадиола и местранола;

– 3-кетогруппе методом косвенной ацидиметрии, после реакции присоединения с гидроксиламина гидрохлоридом (Мм экв = Мм):

HCl + NaOH →NaCl + Н2O

– α-кетольной группе, используя ее способность к восстановлению. Тетрайодмеркуриат калия (реактив Несслера) взаимодействует с кортикостероидами в щелочной среде, при этом выделяется эквивалентное количество металлической ртути, которую окисляют избытком титрованного раствора йода в кислой среде в присутствии избытка калия йодида:

Избыток титранта оттитровывают раствором натрия тиосульфата (Мм экв = Мм/2);

–фторпроизводные глюкокортикоидов определяют после гидропиролитического отщепления фтора методом ториметрии, используя для установления точки эквивалентности индикатор метилтимоловый синий или потенциометрию;

–в основе обратного алкалиметрического определения сложноэфирной группы эстрадиола дипропионата лежит реакция щелочного гидролиза, который проводят в присутствии избытка 0,1 М спиртового раствора КОН. Избыток щелочи оттитровывают кислотой (индикатор – фенолфталеин). Параллельно проводят контрольный опыт (Мм экв = Мм/2).

43

КОН + HCl→ KCl + Н2О

Основное применение титриметрические методы находят при определении субстанций стероидных гормонов. К недостаткам метода можно отнести использование большой навески вещества, поэтому данный метод не находит применения в анализе низкодозированных лекарственных форм стероидных гормонов.

5.2.2. Спектральные методы

Как отмечалось выше, УФ-спектроскопия, в том числе и количественная, является унифицированным методом анализа стероидных гормонов, содержащих следующие функциональные фрагменты в молекуле.

1. α, β-ненасыщенные кетоны (андрогены, анаболики, гестагены, кортикостероиды), которые имеют в этанольных растворах сходные УФспектры с максимумом поглощения в области 230–245 нм различной интенсивности. Метод УФ-спектроскопии рекомендован ГФ XI, МФ и ЕФ для контроля качества как субстанций стероидных гормонов, так и лекарственных форм на их основе.

В случае анализа масляных инъекционных растворов, низкодозированных таблеток, суспензий и мазей можно использовать более чувствительный метод дифференциальной спектроскопии, основанный на восстановлении стероидов борогидридами щелочных металлов до соответствующих спектрально неактивных 3-гидроксипроизводных.

44

Если в кювету сравнения поместить раствор восстановленного 4-3- кетостероида, а в рабочую – раствор невосстановленного соединения с той же концентрацией, то разница оптических плотностей при 240 нм отвечает содержанию ненасыщенного соединения.

Определение спектрально неактивных 5(10)-3-кетостероидов, например норэтинодрела, можно проводить после его превращения в соответствующие спектрально активные 4-3-кетопроизводные путем кислотного или щелочного гидролиза:

Количественное превращение позволяет проводить избирательное определение норэтинодрела в контрацептивных препаратах методом дифференциальной спектроскопии.

2. фенольное кольцо А – спектры очень характеристичны (λmax = 280 нм), но из-за низкой интенсивности поглощения практически не используются для количественного анализа. Для повышения чувствительности метода ЕФ рекомендует проводить количественное определение эстрадиола в 0,1 М растворе гидроксида натрия, измеряя оптическую плот-

ность при 238 нм (Е 1%1см = 335).

Содержание стероидных гормонов в субстанции или лекарственных формах рассчитывают на основании приведенной в частных статьях величины удельного показателя поглощения (Е 1%1см, табл. 6) или с использованием раствора стандартного образца.

Таблица 6

Значения удельного показателя поглощения (Е 1%1см) стероидных гормонов, используемые в НД для количественного определения

		Максимум поглощения	Удельный показатель
Препарат		в УФ-спектре препарата
			поглощения Е 1%1см
		(нм)
1		2	3
		Производные андростана
Тестостерона пропионат		241	490
Метилтестостерон		241	540
	45

			Окончание табл. 6
	1	2	3
		Гестагены
	Прогестерон	241	535
	Медроксипрогестерона	241	426
	ацетат
	Ципротерона ацетат	282	414
		Кортикостероиды
	Дезоксикортикостерона	240	450
	ацетат
	Кортизона ацетат	237	395
	Гидрокортизон	241,5	448
	Гидрокортизона ацетат	241	395
	Преднизон	238	425
	Преднизолон	243,5	415
	Дексаметазон	238,5	394
	Бетаметазон	238,5	395
	Триамцинолон	238	380
		Эстрогены
	Эстрадиола бензоат	231	500

Широкое применение в фармацевтическом и биоклиническом анализе стероидных гормонов находит фотоколориметрия, которая до использования в анализе стероидов хроматографии была единственным достаточно селективным и чувствительным методом анализа стероидных гормонов.

В количественном анализе кетостероидов (андрогены, анаболики, гестагены, кортикостероиды) используют два важнейших метода.

1. Метод с использованием гидразида никотиновой кислоты

(ГИНК) основан на реакции конденсации препарата в растворе метанола, содержащем хлористоводородную кислоту. Для стероидов, содержащих 4- 3-кетогруппы, реакция протекает в течение 20 мин при комнатной температуре. 1,4-3-кетостероиды менее реакционно-способны, поэтому определение проводят при нагревании до 50 °С в течение 1 часа или повышают концентрацию ГИНК.

Преимущества данного метода заключаются в том, что окраска раствора не зависит от природы используемого растворителя (этанол, хлоро-

46

форм и др.) и только для низкодозированных масляных растворов необходимо отделять масло на хроматографической колонке с флорисилом.

Метод ГИНК является унифицированным методом определения кетостероидов в лекарственных формах. ГФ IX использует данный метод для количественного определения преднизолона и гидрокортизона в мазях (ФС

42-3305-96 и ФС 42-1961-96 соответственно).

2. Метод Циммермана основан на взаимодействии 17-кетогрупп стероидных гормонов (эстрон, метаболиты тестостерона) с 1,3-динитро- бензолом в щелочной среде.

Необходимым условием протекания реакции является удобное стерическое расположение кетогруппы по соседству с метиленовой группой. В реакцию не вступают 4-3-кетостероиды и 21-незамещенные-20-кетосте- роиды. Метод Циммермана широко применяется в клиническом анализе для определения 17-кетостероидов в моче.

При фотоколориметрическом анализе эстрогенов находят применение цветные реакции на фенольное кольцо А:

–реакция азосочетания с диазотированными сульфаниловой кислотой, 3-нитроанилином, сульфатиазолом и другими ароматическими амина-

ми (λ = 540–550 нм);

–реакция нитрования ароматического кольца (λ = 400–435 нм);

–реакция восстановления молибдовольфрамофосфата (реактив Фолина) до окрашенного в синий цвет комплекса ((λ = 760 нм);

–реакция образования индофенолового красителя с реактивом Гиб-

бса (λ = 540 нм).

Гораздо большее значение в фармацевтическом фотоколориметрическом анализе эстрогенов имеет более чувствительный метод Кобера и его модификации, основанный на взаимодействии препаратов с минеральными

47

кислотами, в основном серной, или их растворами в различных растворителях (вода, этанол, метанол).

Основная роль кислоты заключается в дегидратации молекулы эстрогена с образованием двойной связи (связей), которые мигрируют к фенольному кольцу А. В ходе этого процесса метальная группа при С13 мигрирует в положение С17, кроме того, происходит сульфирование кольца А при С2. Окраска образующихся продуктов может возникать вследствие протонирования в сильно кислой среде, что приводит к образованию ионов карбонила, способных к резонансу. Вторая стадия метода Кобера носит окислительновосстановительный характер. В результате удлинения π-электронной системы в спектре окрашенного комплекса наблюдается батохромный сдвиг.

Данный метод широко применяется в анализе низкодозированных гормональных препаратов, содержащих этинилэстрадиол и местранол, так как эстрон, эстрадиол и гестагены не вступают в реакцию с серной кислотой в этих условиях.

Несмотря на удовлетворительную чувствительность и селективность реакции с участием реагентов, содержащих серную кислоту, разбавленную этанолом, а также простоту методики, в биофармацевтическом анализе чаще применяют более длительные двухстадийные реакции, обладающие еще более высокой чувствительностью и селективностью, с участием реагентов, содержащих серную кислоту, воду и различные добавки.

Первая стадия основана на классической методике Кобера – пробу лекарственной формы, содержащей эстроген, смешивают с 65 % раствором серной кислоты с добавкой фенола и нагревают – образуется продукт желтого цвета (λ = 450–500 им). На второй стадии смесь разбавляют водой до 40–50 % концентрации серной кислоты и вновь нагревают, окраска переходит в розовую (λ = 560 нм). Вместо фенола можно использовать гидрохинон. Другим важным вариантом метода Кобера является методика Хенни, предложившего реактив, содержащий, помимо серной кислоты, фенола и воды, еще и сульфат железа (III). Присутствие ионов Fe+3 повышает скорость развития окраски и ее стабильность. Метод Хенни включен в Фармакопею США для анализа эстрогенов и их конъюгатов в биожидкостях.

Для фотоколориметрического анализа кортикостероидов предложено множество методик, но основными в фармацевтическом анализе являются следующие.

1.Метод с использованием солей тетразолия рекомендован МФ III

иявляется основным методом анализа субстанций и лекарственных форм глюкокортикоидов и минералокортикоидов.

Ниже представлено уравнение химической реакции между α-кетоль- ной группой кортикостероидов и хлоридом трифенилтетразолия с образованием окрашенного формазана (Е1%1см = 400–405). Реакция 21-эфиров кор-

48

тикостероидов с солями тетразолия протекает медленно, поэтому необходимо провести предварительный гидролиз в щелочной среде. 11-кетопроиз- водные более реакционно-способны, чем 11β-производные. Основным недостатком реакции с солями тетразолия является влияние кислорода воздуха, вследствие чего ее следует проводить в атмосфере азота.

ЕФ рекомендует использовать данный метод для количественного определения флюоцинолона ацетонида в субстанции.

2. Метод Портера – Зильбера используется для анализа глюкокортикоидов в моче и других биопробах, так как в реакцию окисления фенилгидразином в присутствии серной кислоты вступают только 17α-гидрокси- производные:

Для всех классов стероидных гормонов известны методики спектрофлюориметрического количественного определения. В связи с высокой чувствительностью этот метод чаще всего используется для анализа содержания стероидных гормонов и их метаболитов в биологических объектах.

Из всех классов стероидных гормонов собственной флюоресценцией обладают только эстрогены, в структуре которых присутствует ароматическое кольцо А. Максимум возбуждающего излучения эстрогенов и их про-

49

стых эфиров находится около 284 нм, а максимум испускания лежит в области 310–327 нм. Низкая интенсивность флюоресценции эстрогенов и малые длины волн возбуждения и испускания ограничивают возможности данного метода. Как правило, эстрогены переводят во флюоресцирующие производные с помощью химических реакций, например, с дансилхлоридом в щелочной среде:

У образующегося дансил производного максимум возбуждающего излучения находится в области 346–366 нм, а максимум спектра испускания – 502–525 нм. Данный метод рекомендован Британской фармакопеей (1980) для количественного анализа этинилэстрадиола в таблетках.

Появление окраски при взаимодействии стероидных гормонов с сильными минеральными кислотами (серной, фосфорной, трихлоруксусной и др.) обычно сопровождается флюоресценцией, это явление используется как для качественного, так и для количественного анализа. Флюоресценция под действием серной кислоты в присутствии этанола применяется для определения эстрогенов в низкодозированных лекарственных формах.

В основе флюориметрического определения метилтестостерона и метандиенона в таблетках лежит реакция с серной кислотой и 80%-ной фосфорной кислотой с добавлением трихлоруксусной кислоты соответственно.

Известны методики спектрофлюориметрического определения глюкокортикоидов в биопробах, основанные на образовании флюоресцирующих производных в присутствии серной кислоты и этанола. Максимумы возбуждения кортикостероидов находятся при длинах волн 470–780 нм, а максимумы испускания – 530–540 см.

5.2.3. Поляриметрия

Все стероидные гормоны являются оптически активными веществами, и их растворы в различных растворителях (этанол, диоксан, пиридин, хлороформ и др.) имеют характерную величину удельного вращения (см. приложение). Измерение величины угла вращения растворов стероидных гормонов проводят как для оценки их чистоты, так и для определения его концентрации в растворе. Однако метод поляриметрии включен только в

50