Preparaty_-_proizvodnye_tsiklopentanpergidrofenantrena__1

группой. Эстрогенные препараты проявляют с помощью реактивов на фенольный гидроксил – с солями диазония в щелочной среде, реактивом Гиббса и др.

Выбор системы растворителей зависит от структурных особенностей молекулы стероидных гормонов, наличия функциональных групп, влияющих на хроматографическое поведение стероидных соединений. Чаще всего для идентификации различных классов стероидных гормонов в фармакопейных и нефармакопейных методиках используются следующие системы растворителей:

–производные андростана и гестагены:

хлороформ – ацетон (9 : 1); бензол – ацетон (9 : 1); гексан – ацетон (7 : 3); бензол – этилацетат (8 : 2);

циклогексан – этилацетат (1 : 1);

–кортикостероиды:

хлороформ – метиловый спирт – вода (95 : 5 : 0,2); хлористый метилен – метиловый спирт – вода (95 : 5 : 0,4);

хлористый метилен – эфир – метиловый спирт – вода (77 : 15:8: 0,4); дихлорметан – эфир – метиловый спирт – вода (77 : 15:8: 1,2); хлороформ – ацетон (3:2); н-бутанол – толуол – эфир (5 : 10 :85);

– эстрогены:

гептан – ацетон (8 : 2); гексан – ацетон (7 : 3);

циклогексан – этилацетат – ацетон (75 : 25 : 10); бензол – этилацетат (8 : 2); бензол – эфир – ацетон (50 : 50 : 1); толуол – этиловый спирт (8 : 2).

Подлинность определяется путем сравнения хроматографической подвижности анализируемого и стандартного образца стероидных гормонов. Основное пятно исследуемого стероидного соединения по положению

ицвету должно полностью совпадать с пятном стандартного образца.

Вслучае определения наличия специфических примесей (посторонние стероиды), которые представлены исходными продуктами и полупродуктами синтеза, продуктами гидролитического расщепления и т.д., на пластинку наносится определенное количество стандартного образца препарата, в котором содержатся допустимые количества примесей или рабочего стандартного образца данной примеси. Это позволяет проводить количест-

31

венную оценку содержания примесей с помощью визуального или денситометрического определения, а также методом спектрофотометрии после элюирования вещества из слоя сорбента. Условия определения посторонних стероидов в некоторых препаратах стероидных гормонов представлены в табл. 2.

Таблица 2

Определение посторонних стероидов в субстанциях и лекарственных формах стероидных гормонов методом ТСХ

	Препарат	Система		Стандартный	Результат
		растворителей		образец
	1	2		3	4
		Производные		андростана – субстанции
	Тестостерона	бутилацетат – петро-		Тестостерона	Содержание тестостерона
		лейный эфир – безвод-		пропионат
	пропионат (ЕФ,	ная уксусная кислота		Тестостерона	ацетата не должно
	ст. 297)	(70 : 30 : 1)		ацетат	превышать 1 %.
		бутилацетат – петро-
	Метилтесто-	лейный эфир –		Метилтесто-	Суммарное содержание
	стерон (ЕФ, ст.	безводная уксусная ки-		стерон	примесей не должно пре-
	410)	слота		Тестостерон	вышать 1 %.
		(70 : 30 : 1)
	Этистерон (ЕФ,	хлороформ – метиловый		Этистерон	Не должно быть дополни-
	ст. 142)	спирт			тельных пятен, кроме ос-
		(95 : 5)			новного пятна.
	Норэтистерон	хлороформ – ацетон		Этистерон	Содержание этистерона
	(ЕФ, ст. 234)	(9:1)			не должно
					превышать 0,5 %.
	Левоноргестрел	дихлорметан – этилаце-		Левоноргестрел	Суммарное содержание
	(ЕФ, ст. 926)	тат			примесей не должно пре-
		(8:2)			вышать 0,2 %.
		Гестагены		– субстанции
	Прогестерон	хлороформ – этилаце-		Прогестерон	Суммарное содержание
	(ЕФ, ст. 429)	тат			примесей не должно пре-
		(66 : 33)			вышать 1 %.
		Кортикостероиды – субстанции
	Гидрокортизона	хлороформ – метиловый		Гидрокортизон	Кроме основного пятна,
	ацетат	спирт – вода		Гидрокортизона	должно появиться не бо-
	( ФС 42-2554-
		(95 : 5 : 0,2)		ацетат	лее 4 посторонних пятен.
	95)
				32

				Окончание табл. 2
	1	2	3	4
	Гидрокортизона	хлороформ – метиловый		Суммарное содержание
	ацетат	спирт – вода	Гидрокортизон	примесей не должно
	(НД 42-10579-
		(180 : 15 :1)		превышать 2 %.
	99)
		хлористый метилен –		Кроме основного пятна, не
	Триамцинолон	эфир – метиловый	Триамцинолон	более двух
	(ФС 42-3115-95)	спирт – вода		посторонних
		(77: 15 : 8 : 1)		пятен.
	Флюоцинолона	Дихлорметан – эфир –		Суммарное содержание
	ацетонид (ЕФ,	метиловый	Флюоцинолона	примесей не должно пре-
	ст. 494)	спирт – вода	ацетонид	вышать 2 %.
		(77 : 15 : 8 : 1,2)
		Лекарственные	формы кортикостероидов
	Гидрокортизона
	ацетата	хлороформ – метиловый	Гидрокортизона аце-	Суммарное содержание
	суспензия 2,5 %	спирт – вода		примесей не должно пре-
	для инъекций	(95 : 5 : 0,2)	тат	вышать 4 %.
	(ФС 42-2896-99)
	Кортизона аце-	хлороформ – метиловый	Кортизона	Суммарное содержание
	тата таблетки по	спирт – вода		примесей не должно пре-
	0,025 и 0,05 г		ацетат
		(95 : 5 : 0,2)		вышать 3 %.
	(ФС 42-3424-97)
	Метилпреднизо-			Кроме основного пятна
	лон – лиофил.	хлороформ – этилаце-
			Метилпредни-	(Rf = 0,6), наблюдается
	порошок для	тат – ацетон – уксусная
	инъекций (НД	кислота (60 : 15 : 28 : 8)	золон	дополнительное пятно с
				Rf = 0,5.
	42-8021-97)
		Эстрогены	– субстанции
	Эстрадиола бен-	толуол – этиловый	Эстрадиола	Суммарное содержание
	зоат (ЕФ, ст.	спирт (8 : 2)	бензоат	примесей не должно пре-
	139)			вышать 1 %.
				Суммарное содержание
	Этинилэстради-	толуол – этиловый	Этинилэстрадиол	примесей не должно пре-
	ол (ЕФ, ст. 140)	спирт (9 : 1)	Эстрон	вышать 1 %. Содержание
				эстрона – не более 0,5 %.
	Местранол (ЕФ,	толуол – этиловый		Суммарное содержание
			Местранол	примесей не должно пре-
	ст. 509)	спирт (9 : 1)
				вышать 1%
			33

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). ВЭЖХ является одним из ценных аналитических методов разделения и количественного определения стероидных гормонов. Метод включен в 9 статей на субстанции стероидных гормонов ЕФ (ципротерона ацетат, дезоксикортона ацетат, дексаметазон, эстрадиол, гидрокортизон, преднизон и др.). Основными преимуществами ВЭЖХ в анализе доброкачественности субстанций и лекарственных форм стероидных гормонов являются:

–универсальность, что позволяет подобрать хроматографические системы для разделения всех классов стероидных гормонов;

–простота в приготовлении анализируемых образцов;

–возможность разделения изомеров, например, определение примеси α-эстрадиола в эстрадиоле и бетаметазона в дексаметазоне.

Рассмотрим основные экспериментальные параметры, включенные в НД для анализа субстанций и лекарственных форм стероидных гормонов методом ВЭЖХ.

Тип сорбента и размеры хроматографической колонки. Для опре-

деления профиля примесей стероидных гормонов используются адсорбционные (нормально-фазный режим) и распределительные (обращено-фазный режим) хроматографические системы. В качестве адсорбентов нормальнофазного режима разделения чаще всего используется силикагель с малым размером частиц (5–10 нм), а обращено-фазного – силикагель с привитыми

молекулами октадецилсилана (Кизельгель C18, Бондапак C18, Сепарон C18 и

др.).

Для хроматографического разделения в режиме высокого давления используются стальные колонки длиной 10–25 см с внутренним диаметром

0,3–0,5 см.

Состав элюента и характер элюирования. Для элюирования стеро-

идных гормонов в обращено-фазном режиме ВЭЖХ используются полярные элюенты. Как правило, это 30–40% водные растворы ацетонитрила, а также их смеси с уксусной кислотой или метанолом.

Вадсорбционном варианте ВЭЖХ в качестве элюентов используют смеси: метанол – хлороформ (5 : 70), хлористый бутил – насыщенный водный раствор хлористого бутила – тетрагидрофуран – метанол – безводная уксусная кислота (475 : 475 : 70 : 35 : 30) и др.

Чаще всего используется изократический режим элюирования.

Тип детектора. Для детектирования стероидных гормонов универ-

сальным является УФ-детектор с переменной или фиксированной длиной волны. Детектирование 4- и 1,4-3-кетостероидов (андрогены, анаболики,

34

гестагены и кортикостероиды) проводят при длине волны 254 нм, для эстрогенов выбирают, как правило, специфическую длину волны – 280 нм.

Чувствительность ВЭЖХ существенно увеличивается при использовании электрохимического детектора (предел обнаружения 1 нг). Если эстрогены хроматографировать в виде флюоресцирующих дансилпроизводных, то предел обнаружения составляет ниже 0,05 нг.

5.1.2. Химические методы

Стероидные гормоны содержат в своей структуре ограниченный набор функциональных групп и функциональных фрагментов, пригодных для проведения функционального анализа.

Наличие стероидного цикла в структуре препаратов подтверждается концентрированной серной кислотой, которая является общим внутригрупповым специфическим реактивом. По окраске продуктов реакции, наличию или отсутствию флюоресценции в УФ-области спектра, изменению окраски после добавления воды (МФ III, ЕФ-1997, НД) или хлороформа (ГФ) можно отличить даже близкие по структуре лекарственные средства группы стероидных гормонов.

Методики проведения данной реакции отличаются, так, МФ и ЕФ рекомендует навеску препарата (1–2 мг) растворить в 2 мл концентрированной серной кислоты и через 5 мин должна появиться характерная окраска и

внекоторых случаях флюоресценция в УФ-свете. После чего необходимо добавить 10 мл воды, встряхнуть и зафиксировать изменение окраски и флюоресценции (см. табл. 3).

При испытании подлинности этистерона (прегнина) и норэтистерона методика проведения реакции модифицируется: 2 мг препарата растворяют

в2 мл безводного этанола и добавляют 2 мл концентрированной серной кислоты, смесь нагревают на водяной бане при температуре 70 °С; наблюдают сине-фиолетовое окрашивание с красной флюоресценцией (этистерон) или голубовато-фиолетовое окрашивание с красной флюоресценцией (норэтистерон).

ВГФ на препараты стероидных гормонов реакция с концентрированной серной кислотой используется в трех вариантах: 1) без добавления воды, 2) с добавлением воды и 3) с добавлением воды и хлороформа (см. табл. 4 и 5).

Значительные различия в окраске продуктов реакции с концентрированной серной кислотой для препаратов стероидных гормонов, согласно требованиям ГФ и ЕФ, можно объяснить более высокими требованиями, предъявляемыми ЕФ, к чистоте препаратов (посторонние стероиды).

35

Таблица 3

Окраска продуктов реакции препаратов стероидных гормонов концентрированной серной кислотой (МФ и ЕФ)

		После добавления концентриро-
	Лекарственное	ванной серной кислоты
	вещество	окраска	флюоресцен-
			ция
	Дексаметазон	красно-коричневая	нет
	Гидрокортизон	красно-коричневая	зеленая
	Кортизона ацетат	желтая	нет
	Преднизон	желтая	синяя
	Преднизолон	красная	красно-
			коричневая
	Дезоксикортикор-	желтая	нет
	тона ацетат
	Этинилэстрадиол	оранжево-красная	зеленая
	Местранол	красная	зеленовато-
			желтая
	Ципротерона ацетат	красная	нет

После добавления воды

окраска

нет

нет

нет

нет

серый хлопьевидный осадок

голубая

фиолетовая

розовая, розовый или фиолетовый осадок

фиолетовая

флюоресценция

нет

нет

нет

нет

желтая

красная

нет

нет

нет

Таблица 4

Окраска продуктов реакции препаратов стероидных гормонов концентрированной серной кислотой (ГФ XI)

	Лекарственное	После добавления концентри-		После добавления воды
		рованной серной кислоты
	вещество
		окраска	флюорес-	окраска	флюорес-
			ценция		ценция
	Этинилэстрадиол	оранжево-	желто-зеленая	оранжево-	желто-
		красная		красная	зеленая
	Метандриол	желто-	зеленая	желто-	слабо
		оранжевая		оранжевая	зеленая
	Метилтестостерон	оранжевая	нет	желто-	зеленая
				оранжевая
	Метандиенон	красная	нет	–	–
	Кортизона ацетат	желтая	желтая	–	–
	Преднизон	зеленовато-	желто-	–	–
		желтая	зеленая
	Преднизолон		нет	–	–
	Гидрокортизона ацетат	желтая →	зеленая	–	–
		красная
			36

Таблица 5

Окраска продуктов реакции препаратов стероидных гормонов с концентрированной серной кислотой в хлороформе по ГФ XI

		После добавления воды		После добавления хлоро-
	Лекарственное			форма
	вещество
		окраска	флюоресцен-	нижний слой	верхний
			ция		слой
	Прогестерон	желтая	зеленая	б/цв	б/цв
	Этистерон (прегнин)	малиновая	зеленая	оранжевый	б/цв
	Дезоксикортикортона ацетат	вишневая	зеленовато-	желтый	зеленый
			коричневая

Характерной реакцией идентификации 3-кетогруппы андрогенов, гестагенов и кортикостероидов служит реакция присоединения – элиминирования при взаимодействии с аминами в кислой среде с последующим измерением температуры плавления выделившегося осадка или образованием окрашенного продукта реакции. В качестве реактивов ГФ рекомендует использовать:

–гидроксиламина гидрохлорид (образуются осадки белого цвета)

–оксим этистерона – tпл = 226–232 °С

–оксим тестостерона пропионата – tпл = 166–171 °С

–оксим метилтестостерона – tпл = 210–216 °С;

–2,4-динитофенилгидразин (образуются осадки оранжево-красного

цвета)

–3,20-бис-2,4-динитрофенилгидразон прогестерона – tпл =

= 270–275 °С;

–2,4-динитрофенилгидразон метандиенона;

–фенилгидразин (образуются осадки желтого цвета)

–фенилгидразон преднизолона

–фенилгидразон преднизона.

Фенольное кольцо А эстрогенов обнаруживают по реакции этерификации с бензоилхлоридом, например, этинилэстрадиола бензоат имеет температуру плавления 199–202 °С.

Из цветных реакций на фенольный гидроксил чаще всего используется реакция азосочетания с солями диазония, полученными на основе сульфаниловой кислоты, 3-нитроанилина, сульфатиазола и др.

37

Полученный азокраситель в щелочной среде имеет вишнево-красную окраску, а в нейтральной или слабокислой среде этот продукт представляет собой оранжево-красный осадок.

Для идентификации эстрадиола или эстрадиола бензоата (ЕФ) по 1 мг препаратов смешивают с 0,5 мл свежеприготовленного раствора молибдата аммония в концентрированной серной кислоте (реактив Фреде), появляется голубое окрашивание с интенсивной зеленой флюоресценцией в УФ-свете или желтовато-зеленое окрашивание с интенсивной зеленой флюоресценцией соответственно. После добавления 1 мл концентрированной серной кислоты и 9 мл воды окраска растворов изменяется в розовую с желтоватой флюоресценцией.

Этинильный фрагмент в структуре этинилэстрадиола, прегнина и норэтистерона обнаруживается по реакции солеобразования с ионами серебра за счет подвижного атома водорода:

При использовании в качестве реактива аммиачного раствора нитрата серебра (ЕФ) и нагревании на водяной бане выпадает белый осадок ацетиленида серебра, который при дальнейшем нагревании переходит в серый, а затем на стенках пробирки образуется «серебряное зеркало».

38

α-Кетольная группа (20-кето-21-гидроксигруппа) кортикостероидов проявляет восстановительные свойства и идентифицируется с помощью реактивов Фелинга, Несслера и Толленса, реакция протекает по схеме:

Реакция с 2,3,5-трифенилтетразолия хлоридом и тетразолиевым синим в щелочной среде также основана на восстановительных свойствах α-кетольной группы. ФС и ЕФ рекомендуют использовать ее для идентификации и количественного фотоколориметрического определения флюоцинолона ацетонида и триамцинолона в субстанции и лекарственных формах:

39

Глюкокортикоиды можно определить также реакцией с фенилгидразином в присутствии серной кислоты по появлению желтой окраски раствора.

Ковалентносвязанный фтор фторкортикостероидов (дексаметазон, бетаметазон, триамцинолон и др.) открывают по реакции с ализаринатом циркония после минерализации молекулы со спекающей смесью (KNО3-, Na2CО3).

40