8.3.1. Техника эксперимента и общие приемы анализа
Рассмотрим принципиальные схемы для возбуждения и наблюдения флуоресценции (рис. 8.2). Источник света 1 проходит через светофильтр 2 и направляется кварцевым конденсором 3 на кварцевую кювету с образ- цом 4. Свет флуоресценции направляется стеклянным конденсором 5 на приемник 6. Приемником могут служить глаз (визуальный метод регистрации), фотопластинка или фотометр (объективные методы регистрации). При наблюдении спектров перед приемником ставят спектральный прибор. Наиболее часто используется схема, в которой возбуждающий свет направляется под углом 45° к поверхности кюветы. Если анализируемое вещество не сильно поглощает возбуждающий свет, то можно направлять луч вдоль передней стенки кюветы.
4
5 6 4
5 6
3
3
2 1 2
1
Рис. 8.2. Принципиальная схема флуорометра:
1 – источник освещения; 2 – светофильтр; 3, 5 – конденсоры; 4 – кювета с исследуемым веществом; 6 – приемник
При количественном анализе измерения выхода флуоресценции обычно не производят, а пользуются методом сравнения интенсивности свечения анализируемого вещества с интенсивностью свечения стандартного раствора. Эти измерения удобнее производить при помощи флуорометров, построенных по двулучевой схеме.
Люминесцентный анализ можно проводить: по измерению интенсивности свечения и по изменению степени тушения флуоресценции вещества при добавлении определенного количества тушителя.
При количественном анализе в обоих случаях выбирают оптимальные условия для наблюдения флуоресценции, устанавливают интервал концентраций, в котором выход флуоресценции линейно зависит от концентрации, и составляют градировочную кривую на основании результатов измерения флуоресценции стандартных растворов анализируемого вещества.
8.3.2. Применение люминесцентного анализа в исследовании пищевых продуктов
Каротиноиды обладают флуоресценцией желто-зеленого цвета. Это свойство обычно используют при идентификации хроматограмм.
Пигменты группы хлорофилла обладают интенсивной флуоресценцией темно-красного цвета. В чистых и сухих органических растворителях они флуоресцируют слабо. Флуоресценция резко усиливается при наличии воды, спирта, аминов. По спектру флуоресценции можно определить присутствие ≈ 1 мкг/л хлорофилла. Водорастворимые производные по флуоресценции мало отличаются от хлорофилла.
Свободные формы токоферолов интенсивно флуоресцируют в ультрафиолетовой области при длине волны 340 нм под влиянием возбуждающего света с длиной волны 295 нм. Связанные формы токоферолов можно перевести в свободные обработкой пробы LiАlН4. Выход флуоресценции α-, β- и δ-токоферолов (в расчете на моль вещества) меняется так же, как и их молярные коэффициенты поглощения. Чувствительность метода около 0,005 мкг/мл. Присутствие витамина А не мешает определению токоферола.
Некоторые водорастворимые витамины обладают интенсивной флуоресценцией. Нейтральные растворы рибофлавина (В2) в воде и спирте флуоресцируют желто-зеленым светом (λmax = 535 нм). Выход флуоресценции падает при наличии кислот и щелочей. Эти свойства используются в различных вариантах люминесцентного метода определения витамина В2 в пищевых продуктах. Чувствительность метода составляет в среднем 0,05 мкг/мл.
Витамин В1 определяют по свечению продукта его окисления красной кровяной солью – тиохромом, имеющим интенсивную флуоресцен- цию голубого цвета (λ = 460…470 нм) при возбуждении светом около 260…277 нм.
Амид никотиновой кислоты имеет голубую флуоресценцию, так же, как и продукты окисления фолиевой кислоты.
Растворы аминокислот – фенилаланина, триозина, триптофана – обладают интенсивной флуоресценцией при 282, 303, 348…359 нм соответственно. Алифатические и серосодержащие кислоты и гистидин не люминесцируют.
Люминесценция белков обусловлена наличием в них ароматических кислот. Однако их спектры несколько отличаются от спектров флуоресценции свободных аминокислот. Положение полос может также меняться при изменении рН среды и степени денатурации белка.
Проведению анализа по спектрам флуоресценции предшествует сложная обработка пробы в целях концентрирования и выделения этого типа соединений, а также разделения их на группы.
В настоящее время уделяется очень большое внимание изучению этих соединений, так как полициклические соединения и, особенно, 3,4-бенз-пирен обладают канцерогенными свойствами. Чувствительность метода 10–3 мкг 3,4-бензпирена в 1 кг продукта.
Люминесцентный анализ широко применяется для идентификации компонентов, получающихся при хроматографии. Так, свечение продуктов реакции фосфолипидов с родамином используется для идентификации фосфатидных фракций при их бумажной и тонкослойной хроматографии. Высокая чувствительность люминесцентных индикаторов позволяет использовать их при титровании очень разбавленных растворов мутных или окрашенных сред. Титрование проводят в темном помещении при освещении пробы с помощью ультрафиолетового осветителя с фильтром, поглощающим видимый свет.