Биохимия семестр 1

Функция и особенности строения тРНК.

Транспортные РНК (тРНК) являются молекулами-адапторами, у которых

к 3' концу присоединяется аминокислота, а к участку антикодона — мРНК.

Семейство тРНК включает более 30 различных по первичной структуре молекул, состоящих примерно из 80 нукл еотидов. тРНК содержат 10– 20%модифицированных или минорных нуклеотидов, в состав которых входят метилированные или восстановленные азотистые основания, нуклеотиды с С — С связью между азотистым

основанием и рибозой, а также некоторые другие варианты. Вторичная структура тРНК описывается структурой «клеверного листа», где наряду с 70% спирализованных участков цепи имеются одно цепочечные петлеобразные фрагменты

Третичная структура молекул за счет дополнительной компактизации приобретает Г-образную конформацию. На долю тРНК приходится около 15% всей РНК клетки;

Активация аминокислот.

Для каждой из 20 аминокислот имеется соответствующая аминоацил-тРНК- лигаза, которая в цитоплазме соединяет аминокислоту с тPHK. Этот процесс активации аминокислот осуществляется в две стадии.

Сначала аминокислота связывается с ферментом и реагирует с АТФ (АТР), образуя макроэргический смешанный ангидрид — аминоациладенилат.

Затем аминоацильный остаток переносится на концевую 3'-ОН-группу концевого остатка рибозы тРНК (другой группой лигаз аминоацил переносится на 2'-ОН-группу). В аминоацил-тРНК карбоксильная группа аминокислотного остатка этерифицируется остатком рибозы 3'-концевого остатка аденозина, входящего в последовательность ...ССА- 3'.

Точность трансляции зависит, прежде всего, от субстратной специфичности аминоацил-тРНК-лигаз. Корректирующий механизм активного центра лигазы обеспечивает немедленное удаление ошибочно присоединенных аминокислотных остатков. В среднем встречается только одна ошибка на 1300 аминокислотных остатков — поразительно высокая точность «работы», если представить, насколько близки структуры некоторых аминокислот.

Aминоацил-тРНК – активная форма аминокислот

Транскрипция

Субстраты:

матрица – одна из цепей ДНК,

растущая цепь – РНК,

субстрат для синтеза – рибонуклеотиды (УТФ, ГТФ, ЦТФ, АТФ),

источник энергии – УТФ, ГТФ, ЦТФ, АТФ.

ферменты РНК-полимеразы и белковые факторы транскрипции.

Биосинтез РНК происходит в участке ДНК, который называется транскриптон, с одного края он ограничен промотором (начало), с другого – терминатором (конец).

РНК-полимеразы эукариот имеют по две больших субъединицы и несколько малых субъединиц.

Инициация

Промотор содержит стартовый сигнал транскрипции – ТАТА-бокс. Так называется определенная последовательность нуклеотидов ДНК, связывающая первый фактор инициации ТАТА-фактор. Этот ТАТА-фактор обеспечивает присоединение РНКполимеразы к той нити ДНК, которая будет использоваться в качестве шаблона для транскрипции (матричная нить ДНК). Так как промотор ассиметричен ("ТАТА"), то он связывает РНКполимеразу только в одной ориентации, что определяет направление транскрипции от 5'-конца к 3'-концу (5'→3'). Для связывания РНК-полимеразы с промотором необходим еще один фактор инициации – σ-фактор (греч. σ – "сигма"), но сразу после синтеза затравочного фрагмента РНК (длиной 8- 10 рибонуклеотидов) σ-фактор отрывается от фермента.

Другие факторы инициации раскручивают спираль ДНК перед РНК-полимеразой.

Элонгация

На этапе элонгации происходит синтез РНК в соответствии с информацией, содержащейся в гене ДНК, при этом факторы инициации удаляются, а фактор элонгации присоединяется. По мере движения РНК-полимеразы по нити ДНК к освободившемуся промотору присоединяются новые молекулы фермента, поэтому один ген может одновременно транскрибироваться несколькими молекулами РНКполимеразы.

Терминация

РНК-полимераза остановится, когда достигнет терминирующих кодонов

(сайта терминации). С помощью белкового фактора терминации, так называемого ρ-фактора (греч. ρ – "ро"), от матрицы ДНК отделяются фермент и синтезированная молекула РНК, которая является первичным транскриптом, предшественником мРНК или тРНК или рРНК.

Процессинг.

Процессинг предшественника матричной РНК

1. Сплайсинг (англ. splice – склеивать встык) – особый процесс, в котором при участии малых ядерных РНК происходит удаление интронов и сохранение экзонов.

2. Кэпирование (англ. cap – шапка) –

происходит еще во время транскрипции. Процесс состоит в присоединении к 5'- трифосфату концевого нуклеотида премРНК 5'-углерода N7-метил-гуанозина.

"Кэп" необходим для защиты молекулы РНК от экзонуклеаз, работающих с 5'- конца, а также для связывания мРНК с рибосомой и для начала трансляции.

3. Полиаденилирование – при помощи полиаденилат-полимеразы с использованием молекул АТФ происходит присоединение к 3'-концу РНК от 100 до 200 адениловых нуклеотидов, формирующих полиадениловый фрагмент – поли(А)- хвост. Поли(А)-хвост необходим для защиты молекулы РНК от экзонуклеаз, работающих с 3'-конца.

Процессинг предшественника рибосомальной РНК

Предшественники рРНК являются более крупными молекулами по сравнению со зрелыми рРНК. Их созревание сводится к разрезанию прерибосомной РНК на более мелкие формы, которые уже непосредственно участвуют в формировании рибосомы. У эукариот существуют четыре типа рРНК – 5S-, 5,8S-, 18S- и 28S-рРНК. При этом 5S-

рРНК синтезируется отдельно, а большая прерибосомная 45S-РНК расщепляется специфичными нуклеазами с образованием 5,8S-рРНК, 18S-рРНК и

28S-рРНК

У прокариот молекулы рибосомальной РНК совсем иные по своим свойствам (5S-, 16S-, 23S-рРНК), что является основой изобретения и использования ряда антибиотиков в медицине.

Процессинг предшественника транспортной РНК

1. Модификация нуклеотидов в молекуле путем дезаминирования,

метилирования, восстановления.

Например, образование псевдоуридина и дигидроуридина.

2.Формирование антикодоновой петли происходит путем сплайсинга и

удаления интрона в средней части претРНК.

3.Формирование на 3'-конце последовательности ЦЦА. Для этого у одних пре-тРНК с 3'-конца удаляются лишние нуклеотиды до "обнажения" триплета ЦЦА, у других идет присоединение этой последовательности.

Рибосомы: особенности строения у прокариот и эукариот. Активные центры рибосом. Полирибосомы.

Рибосомы эукариот:

Они очень мелкие (около 20 нм), но многочисленные (тысячи и даже миллионы на клетку), состоят из двух частей – субъединиц. В состав

субчастиц входят рибосомальные РНК (рРНК) и рибосомные белки, т. е. рибосомы по химическому составу являются рибонуклеопротеидами.

Однако в них также присутствует небольшое количество низкомолекулярных соединений. Из-за многочисленности рибосом, рРНК составляет более половины от всей РНК клетки.

Одну из субъединиц называют «малой», вторую – «большой».

В собранной из субъединиц рибосоме выделят два или три участка, которые называют сайтами. Один из участков обозначают A (aminoacyl) и называют аминоацильным, второй — P (peptidyl) — пептидильный. Данные сайты являются основными каталитическими центрами протекающих на рибосомах реакций. Третий участок обозначают E (exit), через него освободившаяся от синтезируемого полипептида транспортная РНК (тРНК), покидает рибосому.

Когда субъединицы диссоциированы (разъединены) специфичность сайтов теряется, т. е. они определяются сочетанием соответствующих областей обеих субъединиц.

Отличие рибосом прокариот и эукариот.

Соотношение по массе белков и РНК в рибосоме примерно поровну. Однако у прокариот белков меньше (около 40%).

Размеры как самих рибосом, так и субъединиц выражают в скорости их седиментации (осаждения) при центрифугировании.

Упрокариот рибосомы имеют размер в 70S, а у эукариот — в 80S (т. е. они тяжелее и крупнее). При этом субъединицы прокариотических рибосом имеют значения 30S и 50S, а эукариотических — 40S и 60S. Размеры рибосом в митохондриях и хлоропластах эукариот сходны с прокариотическими (хотя имеют определенную вариабельность по размерам), что может указывать на их происхождение от древних прокариотических организмов.

Упрокариот в состав большой субъединицы рибосом входит две молекулы рРНК и более 30 молекул белка, в состав малой — одна молекула рРНК и около 20 белков. У эукариот в субъединицах больше молекул белка, а также в большой субъединице три молекулы рРНК. Составляющие рибосому белки и молекулы рРНК обладают способностью к самосборке и в итоге образуют сложную трехмерную структуру. Структуру рРНК поддерживают ионы магния.

Полирибосомы

Продолжительность жизни мРНК невелика, поэтому для эффективности синтеза белка на каждой мРНК может располагаться не одна, а несколько рибосом, встающих последовательно друг за другом и синтезирующих пептидные цепи. Такие образования называются

полирибосомы.

Трансляция.

Трансляция (биосинтез белка) –процесс,

в ходе которого информация о структуре белка, записанная в виде линейной последовательности нуклеотидов в молекуле зрелой мРНК, «переводится на язык аминокислот» при участии тРНК и рибосом. В результате образуется молекула белка со строго определенной первичной структурой.

Биосинтез белков или трансляция происходит на рибосомах, внутриклеточных белоксинтезирующих органеллах, и включает 5 ключевых элементов:

матрица – матричная РНК,

растущая цепь – полипептид,

субстрат для синтеза – 20 протеиногенных аминокислот,

источник энергии – ГТФ,

рибосомальные белки, рРНК и белковые факторы.

Инициация

Для инициации необходимы мРНК, ГТФ, малая и большая субъединицы рибосомы, три белковых фактора инициации (ИФ-1, ИФ-2, ИФ-3), метионин и тРНК для метионина.

В начале этой стадии формируются два тройных комплекса:

первый комплекс – мРНК + малая субъединица + ИФ-3,

второй комплекс – метионил-тРНК + ИФ-2 + ГТФ.

После формирования тройные комплексы объединяются с большой субъединицей рибосомы. В этом процессе активно участвуют белковые факторы инициации, источником энергии служит ГТФ. После сборки комплекса инициирующая метионил-тРНК связывается с первым кодоном АУГ матричной РНК и

располагается в П-центре (пептидильный центр) большой субъединицы. А-центр (аминоацильный центр) остается свободным, он будет задействован на стадии элонгации для связывания аминоацил-тРНК.

Элонгация включает три последовательные стадии.

1. Связывание аа-тРНК в А-центре.

К свободному А-центру присоединяется аа-тРНК, у которой антикодон комплементарен кодону мРНК, находящемуся в области этого центра. Для того чтобы это событие стало возможным, в структуре рибосомы происходят конформационные изменения, требующие затраты энергии ГТФ и участия фактора элонгации EF1.

2. Образование пептидной связи.

Между α-NH2-группой аминокислоты, находящейся в А центре в составе аатРНК, и карбоксильной группой метионина или другой аминокислоты, входящей в растущую полипептидную цепь, которая присоединена к тРНК Р- центра, образуется пептидная связь. Катализирует реакцию пептидилтрансфераза. Продуктом реакции становится удлиненная на одну аминокислоту пептидил-тРНК, расположенная в А-центре рибосомы.

3. Транслокация — перемещение рибосомы по мРНК. Рибосома продвигается по мРНК на один кодон в направлении от 5'- к 3'-концу с использованием энергии ГТФ и при участии фактора элонгации еEF2. В результате в рибосоме пептидил-тРНК из А-центра попадает в Р-центр, а в А-центре оказывается следующий кодон мРНК. тРНК, которая передала Мет или растущий пептид на аминокислоту аа-тРНК, на 2 этапе теряет связь с Р- центром и уходит в цитозоль клетки.

Терминация.

Когда в А-центр рибосомы попадает один из стоп-кодонов мРНК: UАА, UАG, UGА, белковые факторы терминации RF1, RF3 узнают эти кодоны и освобождают вновь синтезированный пептид из связи с последней РНК, субъединицами рибосомы и мРНК. Этот этап энергозависим и сопровождается гидролизом ГТФ.

Посттрансляционные модификации белков.

•фолдинг молекул. В процессе синтеза полипептидных цепей на рибосоме при участии белков — шаперонов происходит формирование термодинамически наиболее выгодной пространственной конформации;

•образование дисульфидных связей между остатками цистеина. Эта модификация имеет важное значение для проявления активности многих белков (инсулина, иммуноглобулинов, рибонуклеазы и др.);

•частичный протеолиз, который имеет место при синтезе всех белков на экспорт и некоторых внутриклеточных белков;

•присоединение простетической группы, обеспечивающее образование сложных белков;

•сборку протомеров в олигомерные белки, необходимую для образования молекул с четвертичной структурой;

•модификацию аминокислотных

остатков, свойственную многим белкам.

Так, фосфорилирование гидроксильных групп в остатках Сер, Тре и Тир,

гидроксилирование остатков Про и Лиз в молекулах коллагенов; карбоксилирование остатков Глу в факторах свертывания крови II, VII, IХ, Х и др.,

метилирование остатков Арг и Лиз в молекулах гистонов;

йодирование остатков Тир в белке щитовидной железы тиреоглобулине

5.Регуляция экспрессии генов у прокариот. Теория «оперона». Механизмы индукции и репрессии генов у эукариот.

1. Особенности экспрессии генов у прокариот и эукариот.

Регуляция экспрессии генов у прокариотов. Теория оперона.

В 1961 году при исследовании индукции синтеза фермента — β-галактозидазы, участвующего в расщеплении лактозы в клетках E. coli, было установлено следующее: когда клетки E. coli растут на среде, содержащей глюкозу, то в них содержится менее 10 молекул β- галактозидазы на клетку. Если же в среде глюкозу заменить на лактозу, то через несколько минут наблюдается индукция синтеза белков, и концентрация ферментов утилизации лактозы увеличивается в сотни раз.

Это явление объяснила теория оперона, доказавшая, что на молекуле ДНК можно обнаружить участки — опероны,

которые содержат информацию о группе функционально взаимосвязанных структурных белков, и регуляторную зону (участки оператора и гена регулятора), контролирующую транскрипцию этих генов.

Экспрессия структурных генов определяется способностью РНКполимеразы связываться с промотором, расположенным на 5'-конце оперона. Присоединение фермента зависит от

оператора, участка ДНК, который находится рядом с промотором и даже частично с ним перекрывается.

Оператор может связываться с белкомрепрессором, который синтезируется в клетке с постоянной скоростью. Строение белка-репрессора кодирует мРНК, транскрибируемая с гена-регулятора, расположенного на определенном расстоянии от

оперона, работу которого он контролирует. Если белок-репрессор присоединяется к оператору, то РНКполимераза не может связаться с промотором и транскрипция структурных генов не идет. Белки, участвующие в утилизации лактозы, практически не синтезируются.

Когда в среде появляется индуктор — лактоза и присоединяется к белку репрессору, то последний изменяет конформацию и теряет сродство к оператору. РНК-полимераза связывается с промотором, структурные гены транскрибируются, синтезируется одна полицистронная молекула мРНК, содержащая информацию о трех белках: β-галактозидазе, пермеазе и галактозидтрансацетилазе, необходимых для утилизации лактозы клетками.

Структура лактозного оперона:

Лактозный оперон (lac operon) состоит из трех структурных генов, промотора, оператора и терминатора. Принимается, что в состав оперона входит также генрегулятор, который кодирует белокрепрессор.

Структурные гены лактозного оперона - lacZ, lacY и lacA.

lacZ кодирует фермент β-галактозидазу - фермент, расщепляющий дисахарид лактозу на глюкозу и галактозу.

lacY кодирует β-галактозидпермеазу, мембранный транспортный белок, который переносит лактозу внутрь клетки.

lacA кодирует β- галактозидтрансацетилазу, фермент, преносящий ацетилную группу от ацетил-КoA на бета-галактозиды.

Триптофановый оперон:
Триптофановый оперон в целом отвечает
за синтез триптофана.
Функционирование триптофанового
оперона противоположно лактозному.
Регуляция осуществляется по механизму
репрессии.
1. В отличие от лактозного оперона,
белок-репрессор синтезируется в
неактивном состоянии и не может
заблокировать транскрипцию генов,
кодирующих ферменты синтеза
триптофана. Синтез этой аминокислоты
будет в клетке продолжаться до тех пор,
пока в питательной среде не появится
триптофан.
2. Триптофан соединяется с белком-
репрессором и активирует его. Далее
такой активный комплекс присоединяется
к гену-оператору и блокирует
транскрипцию. Таким образом, при
наличии триптофана в среде
прекращается его внутриклеточный
синтез, экономятся ресурсы и энергия
бактериальной клетки.В этом случае
триптофан является репрессором
транскрипции.	.

Регуляция генной экспрессии у эукариот

•На определенных стадиях дифференцировки от гамет до взрослого состояния гены молекулы ДНК экспрессируются в разные периоды времени и в определенной последовательности.

•В дифференцированных клетках хроматин

приобретает такую укладку, что остается

небольшое число генов (5–10%),

способных транскрибироваться.

•В участках гетерохроматина молекула ДНК упакована очень компактно и не транскрибируется.

•В участках эухроматина молекула ДНК имеет более рыхлую укладку и способные связывать РНКполимеразу

Амплификация – это увеличение количества генов, точнее многократное копирование одного гена. Естественно, все полученные копии равнозначны и одинаково активно обеспечивают транскрипцию.

Энхансеры (англ. to enhance – усиливать)

– это участки ДНК в 10-20 пар оснований, способные значительно усиливать экспрессию генов той же ДНК. В отличие от промоторов они значительно удалены от транскрипционного участка и могут располагаться от него в любом направлении (к 5'-концу или к 3'-концу). Сами энхансеры не кодируют какие-либо белки, но способны связываться с регуляторными белками (подавляющими транскрипцию).

Сайленсеры (англ. silence – молчание) –

участки ДНК, в принципе схожие с энхансерами, но они способны замедлять транскрипцию генов, связываясь с регуляторными белками (которые ее активируют).

Перестройка генов.

К подобным процессам относится кроссинговер – обмен участками гомологичных хромосом, и более сложный процесс – сайт-специфичная рекомбинация, которая изменяет положение и порядок нуклеотидных последовательностей в геноме.

Процессинг мРНК – некоторые пре-мРНК подвергаются разным вариантам сплайсинга (альтернативный сплайсинг) в результате чего образуются разные мРНК, и соответственно, белки с разной функцией.

Изменение стабильности мРНК – чем выше продолжительность жизни мРНК в цитозоле клетки, тем больше синтезируется соответствующего белка.

Аминокислоты: строение и классификация. Белки и пептиды. Уровни структурной организации и классификация белков.

1. Аминокислоты: принципы строения, классификация. Пептидная связь.

Аминокислоты – это строительные блоки макромолекул белков.

По строению они являются органическими карбоновыми кислотами, у которых, как минимум, один атом водорода замещен на аминогруппу.

Таким образом, в аминокислотах обязательно присутствует

карбоксильная группа (СООН), аминогруппа (NH2), асимметричный атом углерода и боковая цепь (радикал R). Строением боковой цепи аминокислоты и отличаются друг от друга. Именно радикал придает аминокислотам большое разнообразие строения и свойств.

Классификация аминокислот может проводиться в зависимости от какого-либо свойства или качества аминокислот:

1.В зависимости от положения аминогруппы по отношению к С2 (α-углеродный атом) на α-аминокислоты, β-аминокислоты и др.

2.По абсолютной конфигурации молекулы на L- и D-стереоизомеры.

3.По оптической активности в отношении плоскости поляризованного света – на право- и левовращающие. Наличие ассиметричного атома углерода (хирального центра) делает возможным только два расположения химических групп вокруг него. Это приводит к особому отличию веществ друг от друга, а именно – изменению направления вращения плоскости поляризации поляризованного света, проходящего через раствор.

4.По участию аминокислот в синтезе белков – протеиногенные и непротеиногенные.

5.По строению бокового радикала –– неполярные (алифатические, ароматические) и полярные (незаряженные, отрицательно и положительно заряженные), содержащие

дополнительные СООН- и NH2-группы.

6.По кислотно-основным свойствам –

нейтральные (большинство), кислые (Асп, Глу) и основные (Лиз, Арг, Гис) аминокислоты.

7. По необходимости для организма – незаменимые (Лей, Иле, Вал, Фен, Три, Тре, Лиз, Мет) и заменимые. Две аминокислоты являются условно незаменимыми (Арг, Гис), т.е. их синтез происходит в недостаточном количестве.