Биохимия семестр 1

Способы регуляции активности ферментов

1. Доступность субстрата или кофермента

Здесь работает закон действия масс – фундаментальный закон химической кинетики: при постоянной температуре скорость химической реакции пропорциональна произведению концентрации реагирующих веществ. Или упрощенно – скорость, с которой вещества реагируют друг с другом, зависит от их концентрации. Таким образом, изменение количества хотя бы одного из субстратов прекращает или начинает реакцию.

Например, для цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) таким субстратом является оксалоацетат (щавелевоуксусная кислота). Наличие оксалоацетата "подталкивает" реакции цикла, что позволяет вовлекать в окисление молекулы ацетил-SКоА.

2. Компартментализация

Компартментализация – это сосредоточение ферментов и их субстратов в одном компартменте (одной органелле) – в эндоплазматическом ретикулуме, митохондриях, лизосомах, ядре, плазматической мембране и т.п.

Например, ферменты цикла трикарбоновых кислот и β-окисления жирных кислот расположены в митохондриях, ферменты синтеза белка – в рибосомах.

3. Генетическая регуляция

Генетическая регуляция (изменение количества фермента) может происходить в результате увеличения или снижения его синтеза.

Конституитивные – такие ферменты, которые образуются в клетке постоянно, независимо от наличия субстрата (нейрональная NO-синтаза, ферменты гликолиза, β-окисления жирных кислот, репарации ДНК).

Индуцируемые – синтез этих ферментов возрастает при наличии соответствующих стимулов - индукторов.

Репрессируемые – образование таких ферментов в клетке при необходимости подавляется.

Изменение скорости синтеза фермента (индукция или репрессия) обычно зависит от количества определенных гормонов или метаболитов процесса.

Примеры индуцируемых ферментов:

гормоны глюкокортикоиды стимулируют синтез ферментов глюконеогенеза, что обеспечивает стабильность концентрации глюкозы в крови при длительном голоданиии и устойчивость ЦНС к стрессу, исчезновение пищеварительных ферментов при длительном голодании и индукция их синтеза в восстановительный период в результате возобновления секреции гормонов ЖКТ.

при беременности и после родов в молочной железе индуцируется синтез фермента лактозосинтазы под воздействием лактотропного гормона.

токсические субстраты (например, этанол и барбитураты) стимулируют в печени синтез "своего" изофермента цитохрома Р450, который окисляет и обезвреживает эти вещества, при активации цитокинами моноцитов и макрофагов в них начинается синтез индуцируемой NOсинтазы.

Примеры репрессируемых ферментов:

В печени репрессия фермента синтеза холестерола ГМГ-SKoA-редуктазы под влиянием холестерина и желчных кислот,

в печени репрессия синтеза ферментов глюконеогенеза под действием инсулина,

подавление синтеза триптофана бактериями при деятельности триптофанового оперона.

4.Ограниченный

(частичный) протеолиз проферментов.

Ограниченный (частичный) протеолиз проферментов подразумевает, что синтез некоторых ферментов осуществляется в виде более крупного предшественника и при поступлении в нужное место этот фермент активируется через отщепление от него одного или нескольких пептидных фрагментов. Подобный механизм защищает внутриклеточные структуры от повреждений.

Примером служит активация протеолитических ферментов желудочнокишечного тракта (трипсиноген, пепсиноген, прокарбоксипептидазы), факторов свертывающей системы крови, лизосомальных ферментов (катепсины).

Секреция ряда ферментов за пределы клетки в неактивном состоянии позволяет предохранить клетки от повреждения (пищеварительные ферменты) или сохранить белок в плазме крови до наступления определенного момента (факторы свертывания крови, белки системы комплемента, калликреинкининовой и ренин-ангиотензиновой систем).

5. Аллостерическая регуляция

Аллостерические ферменты построены из двух и более субъединиц: одни субъединицы содержат каталитический центр, другие имеют аллостерический центр и являются регуляторными. Присоединение эффектора к аллостерической (регуляторной) субъединице изменяет конформацию белка и, соответственно, активность каталитической субъединицы.

Активатор – аллостерический эффектор,

вызывающий повышение активности

фермента.

Ингибитор – аллостерический эффектор,

вызывающий снижение (ингибирование)

активности фермента.

Гетеротропная регуляция: субстрат и

эффектор – разные вещества.

Гомотропная регуляция: субстрат и

эффектор - одно и то же вещество.

Аллостерические ферменты обычно стоят в начале метаболических путей, и от их активности зависит течение многих последующих реакций. Поэтому они часто называются ключевыми ферментами.

В качестве отрицательного регулятора может выступать конечный или промежуточный метаболит биохимического процесса или продукт данной реакции, т.е включается механизм обратной отрицательной связи.

Если регуляторами являются начальный метаболит или субстрат реакции, то говорят о прямой регуляции, она может быть как положительной, так и отрицательной. Также регулятором могут быть метаболиты биохимических путей, каким-то образом связанных с данной реакцией.

Например, фермент энергетического окисления глюкозы, фосфофруктокиназа,

регулируется промежуточными и конечными продуктами этого распада. При этом АТФ, лимонная кислота, фруктозо-1,6-дифосфат являются ингибиторами, а фруктозо-6-фосфат и АМФ – активаторами фермента.

Еще примеры:

В большинстве клеток организма (кроме печени) при регуляции синтеза холестерола аллостерическим ингибитором ключевого фермента этого процесса ГМГ-КоА-редуктазы выступает сам холестерол, что быстро и точно регулирует его количество,

Фермент ЦТК изоцитрат-дегидрогеназа активируется при помощи АМФ и АДФ и ингибируется влияниями АТФ и НАДН.

6. Белок-белковое взаимодействие

Термин белок-белковое взаимодействие обозначает ситуацию, когда в качестве регулятора выступают не метаболиты биохимических процессов, а специфичные белки. После влияния каких-либо факторов на специфичные белки изменяется активность этих белков, и они, в свою очередь, воздействуют на нужный фермент.

1. К примеру, мембранный фермент аденилатциклаза является чувствительным к воздействию мембранного G-белка, который сам

активируется при действии на клетку некоторых гормонов (например, адреналина и глюкагона).

Упрощенная схема активации аденилатциклазы.

2. Еще примером белок-белкового взаимодействия может быть регуляция активности протеинкиназы А через

механизм ассоциации-диссоциации.

Протеинкиназа А является тетрамерным ферментом, состоящим из 2 каталитических (С) и 2 регуляторных (R) субъединиц. Активатором для протеинкиназы А является цАМФ. Присоединение цАМФ к регуляторным субъединицам фермента вызывает их отхождение от каталитических субъединиц. Каталитические субъединицы при этом активируются.

Аденилатциклазный механизм передачи гормонального сигнала. Роль цАМФ.

Циклический АМФ (циклоАМФ, цАМФ) образуется в клетке, когда действуют гормоны гипофиза (ТТГ, ЛГ, МСГ, ФСГ. АКТГ), кальцитонин, соматостатин, глюкагон, паратгормон, адреналин (через α2- и β-адренорецепторы), вазопрессин (через V2-рецепторы).

Механизм наработки цАМФ связан с активацией фермента аденилатциклазы и называется аденилатциклазный механизм.

Этапы аденилатциклазного механизма

1. Взаимодействие лиганда с рецептором приводит к изменению конформации

последнего. Это изменение передается на G-белок (GTP, ГТФ-зависимый), который состоит из трех субъединиц (α, β и γ), α- субъединица связана с ГДФ.

В составе G-белков α-субъединицы бывают двух типов по отношению к аденилатциклазе: активирующие αs и

ингибирующие αi.

Например, в случае действия адреналина с активирующей субъединицей αs взаимодействуют β-адренорецепторы, с ингибирующей – α2-адренорецепторы.

2. В результате взаимодействия с рецептором β- и γ-субъединицы

отщепляются, одновременно на α-субъединице ГДФ заменяется на ГТФ.

3.Активированная таким образом

αs-субъединица стимулирует аденилатциклазу, которая начинает синтез цАМФ. Если в действо была вовлечена αi-субъединица, то она ингибирует аденилатциклазу, все останавливается.

4.Циклический АМФ (цАМФ) –

вторичный мессенджер – в свою очередь связывается с регуляторными (R) субъединицами протеинкиназы А и вызывает их диссоциацию от каталитических. В результате каталитические (C) субъединицы становятся активными.

Протеинкиназа А (ПК А) фосфорилирует ряд ферментов, среди которых киназа фосфорилазы гликогена, гликогенсинтаза, гормончувствительная липаза, транскрипционный фактор CREB (cAMPresponse element-binding protein).

5.Наработка цАМФ продолжается некоторое время, пока α-субъединица, которая является ГТФ-азой, отщепляет фосфат от ГТФ.

6.Как только ГТФ превратился в ГДФ, то α-субъединица инактивируется, теряет свое влияние на аденилатциклазу, обратно соединяется с β- и γ-субъединицами.

7.Все возвращается в исходное положение.

Гормон отрывается от рецептора еще

раньше:

если концентрация гормона в крови велика, то следующая его молекула присоединится к рецептору через малый промежуток времени и повторный запуск АЦ-механизма произойдет быстро – в клетке активируются соответствующие процессы.если гормона в крови мало – для клетки наступает некоторая пауза, изменения метаболизма нет.

7. Ковалентная (химическая) модификация

Ковалентная модификация заключается в обратимом присоединении или отщеплении определенной группы, благодаря чему изменяется активность фермента.

Чаще всего такой группой является фосфорная кислота, реже метильные и ацетильные группы.

Фосфорилирование фермента происходит по остаткам серина и тирозина. Присоединение фосфорной кислоты к

белку осуществляют ферменты

протеинкиназы, отщепление –

протеинфосфатазы.

Присоединение остатка фосфорной

кислоты приводит к изменению конформации активного центра и его

каталитической активности.

Ферменты могут быть активны как в фосфорилированном, так и в дефосфорилированном состоянии.

Например, в мышцах ферменты

гликогенфосфорилаза и гликогенсинтаза

при нагрузке фосфорилируются, при этом фосфорилаза гликогена становится активной и начинает расщепление гликогена и сжигание глюкозы, а гликогенсинтаза при этом неактивна.

во время отдыха при синтезе гликогена оба фермента дефосфорилируются, синтаза при этом становится

активной, фосфорилаза –

неактивной.

Ингибирование ферментов

Подавление активности ферментов обычно называют ингибированием, однако это не всегда корректно.

Ингибитор – это вещество, вызывающее специфичное снижение активности фермента.

Таким образом, неорганические кислоты и тяжелые металлы ингибиторами не являются, а являются инактиваторами, т.к. снижают активность любых ферментов, т.е. неспецифично.

1.По прочности связывания фермента с ингибитором ингибирование бывает

обратимым и необратимым.

2.По отношению ингибитора к активному центру фермента ингибирование делят на

конкурентное и неконкурентное.

Необратимое ингибирование

При необратимом ингибировании происходит связывание или разрушение функциональных групп фермента, необходимых для проявления его активности.

Например, вещество диизопропилфторфосфат прочно и необратимо связывается гидроксигруппой серина в активном центре ацетилхолинэстеразы, гидролизующей ацетилхолин в нервных синапсах. Ингибирование этого фермента предотвращает распад ацетилхолина в синаптической щели, в результате чего отсутствует дальнейшая передача сигнала по нерву.

Конкурентное ингибирование

При таком виде ингибирования ингибитор по своей структуре похож на субстрат фермента. Поэтому он соперничает с субстратом за активный центр, что приводит к уменьшению связывания субстрата с ферментом и нарушению катализа.

В этом состоит особенность конкурентного ингибирования – возможность усилить или ослабить ингибирование через изменение концентрации субстрата.

Например:

1.Конкурентное взаимодействие этанола и метанола за активный центр алкогольдегидрогеназы.

2.Ингибирование сукцинатдегидрогеназы малоновой кислотой, структура которой схожа со структурой субстрата этого фермента – янтарной кислоты (сукцината).

Неконкурентное

ингибирование

Данный вид ингибирования связан с присоединением ингибитора не в активном центре, а в другом месте молекулы. Это может быть аллостерическое ингибирование, когда активность фермента снижается естественными модуляторами (см выше), или связывание с ферментом каких-либо токсинов.

Например, синильная кислота (цианиды) связывается с гемовым железом ферментов дыхательной цепи и блокирует клеточное дыхание.

Индукция фермента – это относительное увеличение скорости синтеза фермента в ответ на появление в среде обитания химического соединения – индуктора. В качестве индуктора может быть относительно редкий субстрат или аналог субстрата. Индуцибельные ферменты часто образуются в клетке при появлении в среде антимикробных веществ.

(см. ген.регуляцию)

метаболический путь - это характерная последовательность химических превращений конкретного вещества в организме.

протеинкиназы – подкласс ферментов киназ. Протеинкиназы модифицируют другие белки путём фосфорилирования остатков аминокислот, имеющих гидроксильные группы или гетероциклической аминогруппы гистидина.

частичный протеолиз – некоторые ферменты синтезируются в виде неактивных предшественников (зимогенов) и активируются только в результате гидролиза одной или нескольких определённых пептидных связей, что приводит к отщеплению части белковой молекулы предшественника. В результате в оставшейся части белковой молекулы происходит конформационная перестройка и формируется активныйцентр фермента.

зимогены - проферменты, или проэнзимы, зимогены, энзимогены функционально неактивные предшественники ферментов, подвергающиеся тем или иным преобразованиям, в результате чего образуется

каталитически активный продукт — фермент.

G-белок - это семейство белков, относящихся к ГТФазам и функционирующих в качестве вторичных посредников во внутриклеточных сигнальных каскадах.

компартментализация – это сосредоточение ферментов и их субстратов в одном компартменте (одной органелле).

вторичные мессенджеры – это внутриклеточные сигнальные молекулы, высвобождаемые в ответ на стимуляцию рецепторов и вызывающие активацию первичных эффекторных белков.

фосфатазы - фермент, который катализирует дефосфорилирование субстрата в результате гидролиза сложноэфирной связи фосфорной кислоты.

аллостерический эффектор – это эффекторные молекулы, которые могут связываться с регуляторными белками, вовлечёнными транскрипцию РНК.

1. Основные разделы медицинской энзимологии. Энзимопатология. Энзимодиагностика.

Энзимология – раздел биохимии, изучающий строение, функционирование и регуляцию активности ферментов.

Энзимопатологии (энзимопатии) –

состояния, связанные с патологическим увеличением или снижением активности ферментов.

Энзимодиагностика – это исследование активности ферментов плазмы крови, мочи, слюны с целью диагностики тех или иных заболеваний.

Энзимотерапия – это использование ферментов в качестве лекарственных средств.

2. Определение и классификация энзимопатий.

Энзимопатологии (энзимопатии) – состояния, связанные с патологическим увеличением или снижением активности ферментов. Наиболее часто встречается снижение их активности с нарушением соответствующих метаболических процессов. При энзимопатологии клиническое значение может иметь

•накопление субстрата реакции, например: фенилаланина при фенилкетонурии, свободного билирубина при физиологических желтухах новорожденных,

•недостаток продукта, например: меланина при альбинизме, катехоламинов при паркинсонизме,

•обе особенности одновременно, как при гликогенозах, сопровождающихся гипогликемией при избытке гликогена в печени.

По характеру нарушения выделяют первичные и вторичные энзимопатии.

Первичные (наследственные)

энзимопатии связаны с генетическим дефектом и наследственным снижением активности.

Наследственные энзимопатии по типу

нарушений метаболизма делят на:

•нарушения обмена аминокислот: фенилкетонурия, альбинизм, алкаптонурия и др.;

•нарушения углеводного обмена: галактоземия, наследственная непереносимость фруктозы, гликогенозы;

•нарушения липидного обмена: липидозы;

•нарушения обмена нуклеиновых оснований: подагры, синдрома Леш-Нихана и др.;

•нарушение обмена в соединительной ткани: мукополисахаридозы, хондродистрофия и др.;

•дефекты ферментов в ЖКТ: муковисцидоз, целиакия, непереносимость лактозы и др.

•нарушения обмена стероидов и т.д.

Вторичные (приобретенные)

энзимопатии возникают как следствие заболеваний органов, вирусных инфекций и т.п., что приводит к нарушению синтеза фермента или условий его работы.

Приобретенные энзимопатии делятся на: алиментарные, токсические и вызванные

различными патологическими

состояниями организма.

•Алиментарные энзимопатии – это заболевания, вызванные изменением количества и активности ферментов вследствие нарушения характера питания.

Алиментарные энзимопатии вызываются дефицитом или дисбалансом в пище:

витаминов (гипо-, авитаминозы);

макро- и микроэлементов;

аминокислот;

жирных кислот;

других БАВ (биологически активных в-в).

Например, алиментарная энзимопатия, вызванная недостаточностью витамина А, проявляется нарушением сумеречного зрения (куриная слепота), воспалением слизистых глаз, ЖКТ, кожи.

•Токсические энзимопатии – это заболевания, вызванные нарушением активности ферментов вследствие действия токсических веществ.

Токсическим веществами являются многие ксенобиотики (соли тяжелых металлов, пестициды, гербециды и т.д.), а также некоторые метаболиты в высоких концентрациях (алкоголь).

Токсические вещества могут либо избирательно угнетать активность (через денатурацию или ингибирование) или синтез отдельных ферментов, либо угнетать весь биосинтез белка (и соответственно всех ферментов).

Например, цианиды и СО прочно связываются с геминовым Fe активного центра цитохромов, что угнетает их активность;

Фториды угнетают активность ферментов, содержащих в активном центре Mg2+;

Ингибиторы, содержащиеся в соевых продуктах, яйцах домашней птицы угнетают активность протеаз ЖКТ - трипсина, химотрипсина, эластазы;

Антивитамины, присутствующие в некоторых пищевых продуктах, или разрушают витамины или конкурентно замещают их в молекулах ферментов, что приводит к угнетению активности этих ферментов.

•Энзимопатии, вызванные различными патологическими состояниями организма.

Так как ферменты имеют оптимумы t, рН и давления, практически любое заболевание, вызывающее нарушения КОС, изменение температуры тела, концентрации активаторов и ингибиторов, меняет активность ферментов организма.

Например, при ацидозе и повышении температуры возрастает активность катаболических (лизосом) и падает активность анаболических ферментов.