Биохимия семестр 1

3. Механизмы первичных и вторичных энзимопатий.

Норма:

Полное или частичное нарушения биосинтеза ферментов вызывают дефекты

генов регуляторных белков, которые

контролируют синтез ферментов:

Нарушение структуры и функции ферментов вызывают дефекты генов этих

ферментов:

У образовавшегося фермента наблюдаются структурные изменения,

которые проявляются в изменении его каталитической активности (как правило,

она исчезает), чувствительности к активаторам и ингибиторам, сродству к субстратам, оптимумам рН, температуры.

В норме метаболический путь протекает следующим образом:

Из-за дефекта в метаболическом пути (цикле, шунте) одного из ферментов в организме происходит накопление промежуточных продуктов (часто токсичных в высоких концентрациях) и дефицит жизненно необходимых конечных продуктов, что приводит к клиническим проявлениям:

Первичные:

Пример: фенилпировиноградная олигофрения (фенилкетонурия) – наследственное заболевание, приводящее в раннем детстве к гибели ребенка или к развитию у него тяжелой умственной отсталости.

Причиной заболевания является отсутствие в печени фермента фен-4-монооксигеназы, которая обеспечивает превращение незаменимой аминокислоты Фен в Тир:

Эта реакция необходима для катаболизма Фен, т.е. удаления его излишков. При отсутствии фен-4-монооксигеназы в организме происходит накопление Фен и превращение его в различные производные: фенилпировиноградную, фенилмолочную и фенилуксусную кислоты.

Фен и его производные в высоких концентрациях токсичны, накапливаясь в тканях, они оказывают на них повреждающее действие. Самой чувствительной к Фен и его производным оказывается нервная ткань детей, она поражается в первую очередь.

Диагноз фенилкетонурия ставят на основании обнаружения Фен в крови или фенилпировиноградной кислоты на пеленках детей. Лечение в основном сводится к исключению из питания ребенка Фен. Для такого ребенка Тир оказывается незаменимой аминокислотой.

4.Принципы и ограничения использования ферментов в качестве биомаркёров заболеваний.

Энзимодиангностика.

Принципы энзимодиагностики основаны на следующих позициях:

•при повреждении клеток в крови или других биологических жидкостях (например, в моче) увеличивается концентрация внутриклеточных ферментов повреждённых клеток;

•количество высвобождаемого фермента достаточно для его обнаружения;

•активность ферментов в биологических жидкостях, обнаруживаемых при повреждении клеток, стабильна в течение достаточно длительного времени и отличается от нормальных значений;

•ряд ферментов имеет преимущественную или абсолютную локализацию в определённых органах (органоспецифичность);

Энзимодиагностика – это исследование активности ферментов плазмы крови, мочи, слюны с целью диагностики тех или иных заболеваний.

Примером может служить фермент

лактатдегидрогеназа, определение его активности в плазме крови необходимо при заболеваниях сердца, печени, скелетной мускулатуры.

Увеличение активности α-амилазы в плазме крови и моче наблюдается при воспалительных процессах в поджелудочной и слюнных железах. Инфаркт миокарда сопровождается увеличением активности

лактатдегидрогеназы, креатинкиназы, аспартатаминотрансферазы.

Изоформы лактатдегидрогеназы. Фермент лактатдегидрогеназа (ЛДГ) катализирует обратимую реакцию окисления лактата (молочной кислоты) до пирувата (пировиноградной кислоты).

Лактатдегидрогеназа-олигомерный белок молекулярной массой 134 000 Д, состоящий из 4

субъединиц 2 типов: М (от англ. muscle - мышца) и Н (от англ. heart - сердце).

Комбинация этих субъединиц лежит в основе формирования 5 изоформ лактатдегидрогеназы.

ЛДГ1 и ЛДГ2 наиболее активны в сердечной мышце и почках, ЛДГ4 и ЛДГ5 - в скелетных мышцах и печени.

•При ряде заболеваний исследуют активность ЛДГ в плазме крови. В норме активность ЛДГ составляет 170-520 ЕД/л. Повышение активности наблюдают при острых поражениях сердца, печени, почек, а также при мегалобластных и гемолитических анемиях.

•Для постановки диагноза необходимо исследование изоформ ЛДГ в плазме крови методом электрофореза.

Выявление в плазме крови тканеспецифических изоформ ЛДГ используют в качестве диагностического теста повреждения данной ткани.

Изоформы креатинкинаы.

Креатинкиназа (КК) катализирует реакцию образования креатин-фосфата:

Молекула КК - димер, состоящий из субъединиц двух типов: М (от англ. muscle - мышца) и В (от англ. brain -

мозг). Из этих субъединиц образуются 3 изофермента - ВВ, МВ, ММ.

Изофермент ВВ находится преимущественно в головном мозге, ММ - в скелетных мышцах МВ - в сердечной мышце.

Активность КК в норме не должна превышать 90 МЕ/л. Определение активности КК в плазме крови имеет диагностическое значение при инфаркте миокарда (происходит повышение уровня МВ-изоформы).

Количество изоформы ММ может повышаться при травмах и повреждениях скелетных мышц.

Изоформа ВВ не может проникнуть через гематоэнцефалический барьер, поэтому в крови практически не определяется даже при инсультах и диагностического значения не имеет.

Энзимодиагностика при инфаркте миокарда

При инфаркте миокарда наблюдают достоверные изменения в крови активности ферментов КК, ЛДГ и аспартатаминотрансферазы - АСТ, которые зависят от времени, прошедшего от начала развития инфаркта и от зоны тканевого повреждения.

После закупорки (окклюзии) коронарного сосуда в крови вначале отмечают повышение активности КК изоформы МВ, однако фермент быстро удаляется из кровотока. Обнаружение повышенной активности КК в плазме крови - основной энзимодиагностический критерий инфаркта миокарда.

Дополнительным подтверждением диагноза инфаркта миокарда служит обнаружение активностей ферментов АСТ и ЛДГ в крови больных.

5.Ферменты как лекарственные препараты. Заместительная энзимотерапия.

Энзимотерапия – это использование ферментов в качестве лекарственных средств.

Использование ферментов в качестве терапевтических средств имеет много ограничений вследствие их высокой иммуногениости. (потенциальная способность антигена вызывать иммунный ответ вне зависимости от его иммунной специфичности)

Тем не менее энзимотерапию активно развивают в следующих направлениях:

Заместительная терапия - использование ферментов в случае их недостаточности;

Элементы комплексной терапии - применение ферментов в сочетании с другой терапией.

Самыми распространенными ферментативными препаратами являются многочисленные комплексы ферментов (Ацидин-пепсин, Фестал, Энзистал, Панкреатин, Мезим форте, Воб-энзим, Креон и т.п.), отличающиеся по источнику ферментов (животная или растительная основа) и содержащие пепсин, трипсин, амилазу, лактазу и т.п., и используемые для заместительной терапии при нарушениях переваривания веществ в желудочно-кишечном тракте.

Тканевой фермент гиалуронидаза нужна организму для обратимого изменения проницаемости межклеточного вещества, в основе которого находится гиалуроновая кислота. Лекарственную форму гиалуронидазы – лидазу – вводят для размягчения рубцов, появления подвижности в суставах, рассасывания гематом.

Цитохром с – белок, участвующий в процессах тканевого дыхания. Его применяют при асфиксии новорожденных, при гипоксии тканей

– астматические состояния, сердечная недостаточность, нарушения мозгового и периферического кровообращения и т.п.

Ферментные препараты используют при онкологических заболеваниях. Аспарагиназа, катализирующая реакцию катаболизма аспарагина, нашла применение для лечения лейкозов:

Предпосылкой антилейкемического действия аспарагиназы послужило обнаружение в лейкозных клетках дефектного фермента аспарагинсинтетазы, катализирующего реакцию синтеза аспарагина.

Лейкозные клетки не могут синтезировать аспарагин и получают его из плазмы крови. Если имеющийся в плазме аспарагин разрушать введением аспарагиназы, то в лейкозных клетках наступит дефицит аспарагина и в результате - нарушение метаболизма клетки.

6.Белки и ферменты как мишени для лекарственных препаратов. Фармакологические аспекты ингибирования ферментов.

Мишенями для лекарственных средств служат рецепторы, ионные каналы, ферменты, транспортные системы и гены.

Весьма широко применяются в настоящее время ингибиторы ферментов, чтобы остановить биохимический процесс, и этим предотвратить накопление патологических продуктов процесса или способствовать сохранению необходимых веществ.

Ингибиторы протеаз (контрикал,

гордокс) при панкреатитах используются при состояниях, когда происходит активирование пищеварительных ферментов в протоках и клетках поджелудочной железы.

Ингибиторы холинэстеразы

(физостигмин, прозерин) приводят к накоплению нейромедиатора ацетилхолина в синапсах и показаны при миастении, двигательных и чувствительных нарушениях при невритах, радикулитах, психогенной импотенции.

Препараты, содержащие ингибиторы моноаминоксидазы (наком, мадопар),

повышают выработку нейромедиаторов катехоламинов в ЦНС при лечении паркинсонизма. Подавление активности моноаминооксидазы (разрушающей катехоламины) сохраняет нормальную передачу сигналов в нервной системе.

Ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента

(каптоприл, эналаприл и т.п.) используются как антигипертензивное средство и вызывают расширение периферических сосудов, уменьшение нагрузки на миокард, снижение артериального давления.

Аллопуринол – ингибитор ксантиноксидазы, фермента катаболизма пуринов, требуется для снижения образования мочевой кислоты и подавления развития гиперурикемии и подагры.

Ингибиторы гидроксиметилглутарил- SКоА-редуктазы (ловастатин,

флувастатин, аторвастатин) применяются для снижения синтеза холестерола при атеросклерозе, заболеваниях сердечнососудистой системы, дислипопротеинемиях.

Ингибитор карбоангидразы

(ацетазоламид) используется как мочегонное средство при лечении глаукомы, отеков, эпилепсии, алкалозах и горной болезни.

Использование ферментов в качестве терапевтических средств имеет много ограничений вследствие их высокой иммуногениости.

Иммуногенность — потенциальная способность антигена вызывать иммунный ответ вне зависимости от его иммунной специфичности.

Лекарственные препараты-ферменты могут вызывать у пациентов нежелательный иммунный ответ, на который влияют различные факторы, в том числе зависящие от пациента, опосредованные заболеванием или лекарственным препаратом.

7.Использование ферментов в качестве реактивов в составе диагностических наборов.

Ферменты используют в качестве специфических реактивов для определения ряда веществ. Так, глюкозооксидазу применяют для количественного определения глюкозы в моче и крови. Фермент уреазу используют для определения содержания количества мочевины в крови и моче. С помощью различных дегидрогеназ обнаруживают соответствующие субстраты, например пируват, лактат, этиловый спирт и др.

Специфичность ферментов к определенным субстратам широко нашла применение в настоящее время в лабораторной диагностике.

• Многие лабораторные методы основаны на взаимодействии добавляемого извне фермента с определяемым соединением. В результате возникает специфичный продукт реакции, после определения содержания последнего судят о концентрации искомого вещества

Глюкозооксидазный метод - при окислении глюкозы кислородом воздуха при каталитическом действии глюкозооксидазы образуется эквимолярное количество перекиси водорода. Под действием пероксидазы перекись водорода окисляет 4 аминоантипирин в присутствии фенола в окрашенное соединение розово малинового цвета, определяемое фотометрически. Применяют для количественного определения глюкозы в моче и крови.

Холестеролоксидазный метод - основан на использовании сопряженных ферментативных реакций, катализируемых:

1)холестеролэстеразой, катализируещей гидролиз эфиров холестерина до свободного холестерина;

2)холестеролоксидазой, катализирующей превращение холестерина в холестенон с образованием перекиси водорода;

3)пероксидазой, катализирующей в присутствии фенола окисление перекисью водорода 4 аминоантипирина с образованием окрашенного продукта розово малинового цвета

•Иммуноферментные методы,

основанные на образовании тройного комплекса фермент-антиген-антитело.

Определяемое вещество не является субстратом фермента, но является антигеном.

Фермент может присоединять этот антиген вблизи от активного центра.

Если в среде есть антиген, то при добавлении антител и формировании тройного комплекса активность фермента изменяется.

Активность фермента измеряют любым способом, при этом активность фермента зависит от количества антигена (определяемого вещества).

1. Принципы строения биологических мембран: образование липидного бислоя, мозаичная модель. Основные компоненты биологических мембран.

Жидкостно-мозаичная модель.

В 1972 г. Сингер и Николсон (Singer, Nicolson)

предложили жидкостно-мозаичную модель мембраны, согласно которой белковые молекулы плавают в жидком фосфолипидном бислое.

Они образуют в нем как бы своеобразную мозаику, но поскольку бислой этот жидкий, то и сам мозаичный узор не жестко фиксирован; белки могут менять в нем свое положение. Покрывающая клетку тонкая мембрана напоминает пленку мыльного пузыря — она тоже все время «переливается».

Мембраны состоят из липидов, белков и углеводов. Липиды составляют в среднем 40% сухой массы мембран. Среди них преобладают фосфолипиды (до 80%).

Основным функциональным компонентом биологических мембран являются белки. Но только образовав прочные комплексы с липидами, они способны проявлять активность.

1.Толщина мембран составляет около 7 нм.

2.Основная структура мембраны— фосфолипидный бислой.

3.Гидрофильные головы фосфолипидных молекул обращены наружу — в сторону водного содержимого клетки и в сторону наружной водной среды.

4.Гидрофобные хвосты обращены внутрь — они образуют гидрофобную часть бислоя.

5.Фосфолипидынаходятся в жидком состоянии и быстро диффундируют внутрибислоя— перемещаются в латеральном направлении.

6.Жирные кислоты, образующие хвосты фосфолипидных молекул, бывают насыщенными и ненасыщенными. В ненасыщенных кислотах имеются изломы, что делает упаковку бислоя более рыхлой.

7.Большая часть белков плавает в жидком фосфолипидном бислое.

8.Белки сохраняют связь с мембраной, т.к. в них есть участки, состоящие из гидрофобных аминокислот, взаимодействующих с гидрофобными хвостами фосфолипидов.

9.Некоторые мембранные белки лишь частично погружены в фосфолипидный бислой.

10.К некоторым белкам и липидам присоединены разветвленные олигосахаридные цепочки, играющие роль антенн. Такие соединения называются соответственно гликопротеинами и гликолипидами.

11.В мембранах содержится также холестерол. Подобно ненасыщенным жирным кислотам он нарушает плотную упаковку фосфолипидов и делает их более жидкими. Холестерол делает мембраны также более гибкими и вместе с тем более прочными.

12.Две стороны мембраны, наружная и внутренняя, различаются и по составу, и по функциям.

2. Функции и свойства биологических мембран.

Свойства биологических мембран:

Замкнутость	Замыкание липидного
	бислоя, приводящее к
	устранению свободных
	краёв плазматической
	мембраны и образованию
	в клетке закрытых
	отсеков-компартментов.
Асимметричность	Отличие химического
	состава наружной
	поверхности мембран от
	внутренней.
Динамичность	Способность отдельных
	молекул мембранных
	липидов и белков
	перемещаться в
	мембране, т.е. сохранять
	способность к диффузии.
Избирательная	Регулируемый перенос
проницаемость	необходимых веществ в
	клетку и удаления из
	клетки продуктов
	метаболизма.

Функции мембран:

1.Барьерная — обеспечивает регулируемый, избирательный, пассивный и активный обмен веществ с окружающей средой. Например, мембрана пероксисом защищает цитоплазму от опасных для клетки пероксидов.

2.Транспортная — через мембрану происходит транспорт веществ в клетку и из клетк]. Транспорт через мембрану обеспечивает: доставку питательных веществ, удаление конечных продуктов обмена, секрецию различных веществ, создание ионных градиентов, поддержание в клетке оптимального pH и концентрации ионов, которые нужны для работы клеточных ферментов.

размеров), но необходимые для клетки, могут проникнуть сквозь мембрану через специальные белки-переносчики (транспортёры) и белки-каналы или путём эндоцитоза.

3.Матричная — обеспечивает определённое взаиморасположение и ориентацию мембранных белков, их оптимальное взаимодействие.

4.Механическая — обеспечивает автономность клетки, её внутриклеточных структур, также соединение с другими клетками (в тканях). Большую роль в обеспечении механической функции имеют клеточные стенки, а у животных — межклеточное вещество.

5.Энергетическая — при фотосинтезе в хлоропластах и клеточном дыхании в митохондриях в их мембранах действуют системы переноса энергии, в которых также участвуют белки.

6.Рецепторная — некоторые белки, находящиеся в мембране, являются рецепторами (молекулами, при помощи которых клетка воспринимает те или иные сигналы).

Например, гормоны, циркулирующие в крови, действуют только на такие клетки-мишени, у которых есть соответствующие этим гормонам рецепторы.

7.Ферментативная — мембранные белки нередко являются ферментами.

3. Классификация и биологические функции мембранных белков.

Классификация:

•Поверхностные белки (около 30% от общего количества мембранных белков) размещены на наружной и внутренней поверхностях мембран и связанные с последними электрическими силами непосредственно или через двухвалентные катионы, преимущественно Са2 + и Mg2 +. Они легко отделяются от мембран после разрушения клеток.

•Внутренние белки (почти 70% общего количества мембранных белков) погружены в двойной слой липидов на разную глубину, а в некоторых случаях пересекают мембрану насквозь. Такие белки связывают обе поверхности мембраны.

Функции мембранных белков:

1.Транспортная - транспорт веществ внутрь и наружу клетки, а также между цитоплазмой и различными субклеточными органеллами (митохондриями, ядром и т.д.) обеспечивается мембранами. Транспортные свойства мембраны характеризуются полупроницаемостью: некоторые соединения могут проникать через нее, а другие — нет:

2.Рецепторная - рецепторную функцию клетки обеспечивают рецепторы, которые реализуют ответные реакции определенными способами. Способ влияния связан с переносом информации, возникающей при присоединении веществ, поступающих извне с рецепторными комплексами мембраны внутрь клетки.

3.Энзиматическая (каталитическая) -

реализована на мембранах органоидов клетки. Большинство синтезируемых в клетке белков выполняют ферментативную функцию. «Усаживаясь» на мембрану в определенном порядке, они организуют конвейер, когда продукт реакции, катализируемый одним белком-ферментом, переходит к следующему.

Такой «конвейер» стабилизируют поверхностные белки плазмалеммы. Например, плазматические мембраны эпителиальных клеток кишечника содержат пищеварительные ферменты.

4.Межклеточное узнавание - на мембране есть антигены, действующие как маркеры — «ярлыки», позволяющие опознать клетку. Это гликопротеины, играющие роль «антенн». Изза бесчисленного множества конфигурации боковых цепей возможно сделать для каждого типа клеток свой особый маркер. С помощью маркеров клетки могут распознавать другие клетки и действовать согласованно с ними, например, при формировании органов и тканей.

5.Образование межклеточных контактов –

Межклеточные контакты — соединения между клетками, образованные при помощи белков. Межклеточные контакты обеспечивают непосредственную связь между клетками. Кроме того, клетки взаимодействуют друг с другом на расстоянии с помощью сигналов (главным образом — сигнальных веществ), передаваемых через межклеточное вещество.

6.Прикрепление к внеклеточному матриксу

Внеклеточный матрикс составляет основу соединительной ткани, обеспечивает механическую поддержку клеток и транспорт химических веществ.

Основные компоненты внеклеточного матрикса — гликопротеины, протеогликаны и гиалуроновая кислота.

Коллаген является превалирующим гликопротеином внеклеточного матрикса у большинства животных. В состав внеклеточного матрикса входит множество других компонентов: белки фибрин, эластин, а также фибронектины, ламинины и нидогены.

4. Классификация механизмов транспорта веществ через мембраны.

Некоторые неполярные соединения могут растворяться в липидном слое и пересекать мембрану самостоятельно, но полярным или заряженным веществам или ионам для трансмембранного движения всегда необходимо участие мембранного белка.

Пассивный транспорт – перенос молекул по концентрационному или электрохимическому градиенту:

• определяется только разностью концентрации переносимого

вещества на противоположных сторонах мембраны;

• осуществляется без затраты энергии АТФ.

Активный транспорт – перенос молекул против градиента концентрации:

•зависит от активности мембранных белковпереносчиков (транспортёров);

•осуществляется с затратой энергии.

Первично-активный транспорт происходит против градиента концентрации с затратой энергии АТФ при участии транспортных АТФаз (например, Na+/K+-АТФаза Сa2+-АТФаза).

Вторично-активный транспорт происходит за счёт градиента концентрации одного из переносимых веществ, который создаётся чаще всего Na+/K+-АТФазой, функционирующей с затратой АТФ.

5. Пассивный транспорт: основные механизмы и биологическая роль. Осмотическое давление и его значение в поддержании целостности клетки. Физиологические растворы.

Если вещество движется через мембрану из области с высокой концентрацией в сторону низкой концентрации (т.е. по градиенту концентрации этого вещества) без затраты клеткой энергии, то такой транспорт называется пассивным, или диффузией. Различают два типа диффузии: простую и облегченную.

Простая диффузия характерна для небольших нейтральных молекул (H2O, CO2, O2), а также гидрофобных низкомолекулярных органических веществ. Эти молекулы могут проходить без какого—либо взаимодействия с мембранными белками через поры или каналы мембраны до тех пор, пока будет сохраняться градиент концентрации.

Облегченная диффузия. Характерна для гидрофильных молекул, которые переносятся через мембрану также по градиенту концентрации, но с помощью специальных мембранных белков — переносчиков.

Для облегченной диффузии, в отличие от простой, характерна высокая избирательность, так как белок переносчик имеет центр связывания комплементарный транспортируемому веществу, и перенос сопровождается конформационными изменениями белка.

•Один из возможных механизмов облегченной диффузии может быть следующим: транспортный белок (транслоказа) связывает вещество, затем сближается с противоположной стороной мембраны, освобождает это вещество, принимает исходную конформацию и вновь готов выполнять транспортную функцию.