Практикум по гистологии

Методы гистологического исследования	11

Для трансмиссионной электрон- Изображения, получаемые

ной микроскопии используются при ТЭМ, отражают распоконтрастирующие агенты. Чаще ложение депозитов тяжевсего используют цитрат свинца и лых металлов. уранилацетат. Предварительная обработка тетраоксидом осмия, который связывается с липидами, позволяет визуализировать и оценивать клеточные мембраны.

Для сканирующей электронной СЭМ позволяет исследовать

микроскопии. СЭМ препараты не поверхность клеток в детаокрашены per se. Их сначала подлях, но тяжелые металлы вергают критическому высушивапредотвращают проникновению, затем погружают в жидкий СО2 ние электронов внутрь и фреон. После критического замоструктур, что не позволяраживания их нагревают до 310 и ет проанализировать их подвергают давлению в 73 атм. При внутренний состав.

этих условиях жидкая и газообразная фазы существуют без поверхностного натяжения, и дегидратация структур происходит без их повреждения. После монтажа срезов их обрабатывают тонкой суспензией частиц тяжелых металлов (например, золота), что обеспечивает визуализацию изображения.

К НАЧАЛУ ГЛАВЫ К "СОДЕРЖАНИЮ"

12	Цитология и общая эмбриология

À

Á

Рис. 1.1.1. Световая микроскопия. Окраска гематоксилином и эозином. Большое увеличение: А – кожа; Б – поджелудочная железа.

À

Á

Â

Рис. 1.1.2. Гистохимическое исследование: А – аденогипофиз. Окраска кристаллическим малиновым, анилиновым синим и желтым красителем Мартиуса – позволяет определять различные эндокринные клетки и элементы стромы; Б – формирующаяся кость. Окраска по методу Малори с азаном. Определяется остеоид и зоны минерализации матрикса костной трабекулы; В – придаток семенника. Окраска гематоксилином и пикриновой кислотой. Визуализируется эпителий выносящих канальцев.

К НАЧАЛУ ГЛАВЫ К "СОДЕРЖАНИЮ"

Методы гистологического исследования	13

Рис. 1.1.3. Иммуноцитохимическое исследование кишечных крипт с использованием моноклональных антител к Ki-67 - маркеру пролиферации клеток. Коричневым цветом окрашиваются делящиеся клетки.

Рис. 1.1.4. Метод иммунофлюоресцентного исследования микротрубочек (зеленый цвет - антитела к тубулину) и ДНК (синий цвет) в культуре клеток. Визуализируется ядро, богатое ДНК, и цитоскелет клетки.

Рис. 1.1.5. Сканирующая электронная микрофотография сосудистого клубочка почки. Благодаря трехмерному изображению видна пространственная ориентация петель капилляров, поверхность которых охвачена ножками подоцитов.

К НАЧАЛУ ГЛАВЫ К "СОДЕРЖАНИЮ"

14	Цитология и общая эмбриология

Рис. 1.1.6. Метод замораживания-скалывания – позволяет проанализировать структуру (рельеф) наружной и внутренней поверхностей плазмолеммы, количество и плотность расположения белков.

Рис. 1.1.7. Трансмиссионная электронная микрофотография цитоплазмы нейрона – позволяет проанализировать ультраструктурный состав цитоплазмы, наличие и количество определенных органелл и т.д.

К НАЧАЛУ ГЛАВЫ К "СОДЕРЖАНИЮ"

Методы гистологического исследования	15

Для проверки самоконтроля решите следующие тестовые задания:

ТЕСТОВОЕ ЗАДАНИЕ 1 Выберите один наиболее правильный ответ.

При исследовании тучной клетки получено трехмерное изображение, которое визуализирует наличие на клеточной поверхности микроворсинок, инвагинаций, отделение секреторных гранул. С помощью какого метода микроскопии была получена эта информация?

А. Фазово-контрастный. Б. Поляризационный.

В. Сканирующая электронная микроскопия.

Г. Трансмиссионная электронная микроскопия. Д. Микроскопия в темном поле.

ТЕСТОВОЕ ЗАДАНИЕ 2 Выберите один наиболее правильный ответ.

Студент для исследования гистологического препарата использует световой мик-

роскоп	с окуляром	× 10 и объективом × 10. Определите уровень увеличения	ïðè ýòîì.
À. 400
Á. 20
Â.	200
Ã.	100
Ä.	1000
		ТЕСТОВОЕ ЗАДАНИЕ 3
		Выберите один наиболее правильный ответ.
	Процесс	изготовления гистологического препарата включает обработку	материа-

ла жидкостью, которая вызывает химическую денатурацию белков, в том числе и ферментов, что предотвращает аутолиз (саморазрушение взятого материала). Назовите этот этап изготовления гистологического препарата.

А. Фиксация.

Б. Обезвоживание.

В. Изготовление срезов. Г. Заливка в парафин. Д. Окрашивание.

ТЕСТОВОЕ ЗАДАНИЕ 4 Выберите один наиболее правильный ответ.

Во время изготовления гистологического препарата использован метод окрашивания гематоксилином и эозином. При этом ядра клеток окрашиваются гематоксилином, что определяется химическим составом этих структур. Какие вещества обеспечи- вают связь с этим красителем?

А. Фосфолипиды. Б. Углеводы.

В. Нуклеиновые кислоты. Д. Щелочи.

Ã.Âîäà è èîíû.

КНАЧАЛУ ГЛАВЫ К "СОДЕРЖАНИЮ"

16	Цитология и общая эмбриология

1.2. ОБЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ КЛЕТКИ. ПЛАЗМОЛЕММА

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ: Эукариотическая клетка является элементарной живой системой, структурной, функциональной и генетической единицей организма человека. Клетки обеспечивают размножение, передачу наследственной информации, рост организма, процессы адаптации, физиологической и репаративной регенерации. В клинической практике широко используется морфологическая оценка форменных элементов крови, клеток влагалищного, буккального, бронхиального эпителия, биоптатов органов и т.д. для уточнения диагноза. Важную роль в поддержании фенотипа и жизнедеятельности клетки играет плазмолемма, которая выполняет защитную функцию, обеспечивает обмен веществ и регуляцию внутриклеточного гомеостаза, определяет форму клетки, способность ее к миграции. В организме человека плазмолемма выполняет интегративную функцию за счет поддержания морфологической и информационной взаимосвязи в межклеточных кооперациях, взаимодействия клеток с межклеточным веществом, контроля морфогенетических процессов и функциональной активности клеток со стороны локальных и системных регуляторов. Нарушение строения и функции плазмолеммы лежат в основе развития различных патологических процессов (инсулиннезависимого сахарного диабета, пузырчатки, гиперхолестеринемии и многих других).

ЦЕЛЬ ОБУЧЕНИЯ (общая): Уметь различать в гистологических препаратах и на электронных микрофотографиях эукариотические клетки и их производые; определять элементарные биологические мембраны, плазмолемму, межклеточные контакты и их разновидности, особенности строения этих структур для понимания их функций.

Для этого необходимо уметь (конкретные цели):

1.Дифференцировать в препаратах и на электронных микрофотографиях гистологи- ческие элементы.

2.Различать в гистологических препаратах и на электронных микрофотографиях клетки, их составные части.

3.	Определять строение и свойства элементарной биологической мембраны.
4.	Интерпретировать строение и функциональное значение плазмолеммы.
5.	Различать на электронных микрофотографиях межклеточные контакты, интер-
	претировать их строение и функции.

ИНСТРУКЦИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ ПОДГОТОВКИ При изучении материала обратите внимание на положения клеточной теории,

которые являются фундаментальным обобщением биологии и характеризуют клетку как целостную самостоятельную единицу. Рассмотрите строение, механизмы образования и свойства различных гистологических элементов, к которым, помимо клетки, относятся симпласт, синцитий, постклеточные структуры и межклеточное вещество, состоящее из волокон и основного аморфного вещества (рис. 1.2.1, 1.2.2).

Используя граф логической структуры темы (приложение 1.2.1), определите, из каких частей состоит клетка. Обратите внимание на разнообразие размеров и формы клеток, имеющих тканевую специфичность (эритроцит имеет форму двояковогнутого диска, нервная клетка имеет отросчатую форму), а также зависящих от факторов внешней и внутренней среды. Оцените роль мембран в образовании и функционировании различ- ных структур клетки – плазмолеммы, мембранных органелл цитоплазмы, ядерной оболочки (рис. 1.2.3). Изучите химический состав мембран и уясните жидкостно-мозаич- ную модель организации элементарной биологической мембраны. Данная модель позволяет интерпретировать особые свойства биологических мембран, благодаря следующим постулатам: 1) белки и липиды асимметрично расположены относительно плоскости мембран; 2) белки и часть липидов могут свободно перемещаться в фосфолипидном

К НАЧАЛУ ГЛАВЫ К "СОДЕРЖАНИЮ"

Общая организация клетки	17

слое благодаря латеральной подвижности; 3) мембраны имеют избирательную проницаемость, которая зависит от наличия в них холестерина, специфических транслоказ (ионных каналов, переносчиков, насосов и пр.); 4) мембраны ассоциированы с цитоплазмати- ческими белками, микрофиламентами и микротрубочками благодаря специальным белкам; 5) синтез и сборка мембран обеспечивается благодаря функционированию эндоплазматической сети и комплекса Гольджи; 6) структурные белки мембраны (интегральные и периферические) обеспечивают ее стабильность, а специфический набор ферментов и переносчиков — определяет многообразие функций; 7) липидный состав мембран может меняться за счет содержания холестерина, сфинголипидов и пр., что отражается на проницаемости мембраны; 8) углеводы в составе гликопротеинов участвуют в процесах адгезии веществ на поверхности мембран, распознавания специфических молекул – иными словами – рецепции.

Уделите особое внимание строению плазмолеммы (клеточной оболочки) и хими- ческому составу ее слоев (рис. 1.2.7). Уясните функции плазмолеммы, увязывая их со структурой слоев (избирательную проницаемость обеспечивает клеточная мембрана; рецепторную функцию реализуют гликопротеиды, углеводные части которых расположены в гликокаликсе; сохранение формы и подвижность обеспечивают фибриллярные и тубулярные белки в подмембранном слое и т.д.). При анализе транспортной функции плазмолеммы обратите внимание на различные способы транспорта веществ (простая диффузия, облегченная диффузия, активный транспорт против электрохимического градиента, эндо- и экзоцитоз).

Простая диффузия – вид транспорта, в основе которого лежит перенос веществ через плазмолемму по концентрационному градиенту без использования специальных молекул и затрат энергии. Примером простой диффузии является транспорт газов (кислород, СО2) через бислой липидов.

Однако перенос через плазмолемму большинства веществ определяется наличием специализированных белковых комплексов – переносчиков, каналов, насосов, рецепторов (рис. 1.2.5, 1.2.6). Например, транспорт воды осуществляется с помощью специ-

альных каналов – аквапоринов, транспорт ионов Na+ обеспечивается с		помощью	èîí-
ных каналов и насосов –	например, Na+,K+-АТФ-азой. Для глюкозы	и аминокислот
существуют специальные	белки-переносчики, активность которых, как	правило,	ñî-

пряжена с работой ионных насосов. Ионные насосы специализированы (для натрия, кальция, магния, ионов водорода). Они представляют собой комплекс белков-канало- формеров, связанных с ферментом – АТФ-азой, расщепляющей молекулы АТФ с освобождением энергии – для транспорта ионов против электрохимического градиента.

Обратите внимание, что эндоцитоз, как правило, происходит с участием рецепторов, распознающих природу транспортируемых веществ (рис. 1.2.8). В осуществлении эндоцитоза принимают участие все три слоя плазмолеммы: рецепторы надмембранного слоя, структурные белки и ферменты мембраны, микрофиламенты подмембранного слоя, меняющие конфигурацию плазмолеммы. В процессе эндоцитоза образуются окаймленные пузырьки, поверхность которых окружена белком клатрином. Эти пузырьки, или эндосомы, транспортируются к определенным компартментам клетки, что определяет сортировку и дальнейшую судьбу (рис. 1.2.9). Поглощенные субстраты поступают в лизосомы, а рецепторы - возвращаются к плазмолемме (рециркуляция рецепторов).

Важнейшей функцией плазмолеммы является рецепторная. С помощью рецепторов клетка “узнает” об изменениях внешней и внутренней среды, адаптируется к ним. На поверхности клетки есть рецепторы к нейромедиаторам, гормонам, локальным факторам регуляции, субстратам, другим клеткам, антигенам и иммуноглобулинам. Благодаря рецепторам клетки находятся под контролем регулирующих систем организма. Активация рецепторов ведет к изменению метаболизма и функциональной активности клеток, регулирует деление (пролиферацию) и созревание (дифференцировку) клеток, их выживание или гибель. Понимание механизмов работы рецепторов и передачи

К НАЧАЛУ ГЛАВЫ К "СОДЕРЖАНИЮ"

ГЛАВЫ НАЧАЛУ К

"СОДЕРЖАНИЮ" К

Составные

части

Биохимический

состав

Функции

Приложение 1.2.1

ГРАФ ЛОГИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ

КЛЕТКА

ПЛАЗМОЛЕММА

ЦИТОПЛАЗМА

ßÄÐÎ

Гиалоплазма

Органеллы

ˆВключения`````````

`

Кариолем-

Хроматин

Ядрышко

Кариоплазма

ма (ядерная

(ядерный сок)

оболочка)

Надмембранный

Клеточная

Подмембран-

слой - гликокаликс

мембрана

íûé ñëîé

Углеводные участки

Липопро-

Микротру-

гликопротеинов кле-

теиновый

бочки, мик-

точной мембраны

комплекс

рофиламенты

Жидкостная фаза - жидкая гомогенная или тонкозернистая коллоидная система

Белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды липиды, связанные с водой и т.д.

Полимерная фаза - микротрабекулярная сеть (система фибрилл)

Связь

Разграниче-

Цитоске-

Объединение кле-

Внутриклеточный

между

íèå,

транс-

ëåò, ïîä-

точных

структур,

каркас, фиксация и

клетками,

ïîðò

âå-

вижность

внутриклеточный

ориентация органелл,

антиген-

ществ, рецеп-

ê ë å ò ê è ,

транспорт веществ,

включений, фермен-

íûå

öèÿ,

защита,

транспорт

ионов,

метаболизм

тов, формирование

свойства,

поддержание

клетки,

отложение

компартментов

рецепция

гомеостаза

включений

18

эмбриология общая и Цитология

Общая	организация клетки			19
(трансдукции) сигнала внутрь клетки		лежит	в основе управления работой клетки.
	В зависимости от принципов работы,		все рецепторы принято разделять на	следу-
þùèå	òèïû (ðèñ. 1.2.12):
	1) рецепторы канального типа	(рецептор+ионный канал). Связь лиганда		(напри-

мер, ацетилхолина) с таким рецептором ведет к открытию ионного канала. Вход ионов вызывает деполяризацию плазмолеммы и формирование потенциала действия, фосфорилирование белков цитоплазмы и включение ответа клетки на стимул. Примером такого вида рецепторов могут быть N-холинорецепторы;

2) рецепторы метаболического типа – рецептор+фермент (тирозинкиназа). Данный тип рецепторов характерен для инсулина и многих факторов роста. Связь инсулина с рецептором ведет к активации тирозинкиназы, фосфорилированию белков, изменению функционального состояния клетки;

3) рецепторы, ассоциированные с G-белками. Большинство регуляторов (медиа-

торы, гормоны) связывается с рецепторами, ассоциированными с G-белком. Это	ведет
к активации G-белка, стимулирующего аденилатциклазу. Последняя катализирует	îá-

разование циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) из АТФ. цАМФ модулирует внутриклеточные ферменты, транспортные процессы и обмен веществ.

В любом случае передача сигнала с рецептора внутрь клетки обеспечивается с помощью сигнальной системы, участниками которой являются вторичные посредники (мессенджеры) и трансдукторы. В общем сигнальная система включает:

СИГНАЛ

РЕЦЕПТОР

Вторичные

Трансдук-

Эффекторные

ОТВЕТ

посредники

торы

молекулы

Изменение

Мембранные

цАМФ,

Протеинки-

ДНК, белки-

Изменение

параметров

Немембран-

цГМФ,

назы А, С, G,

ферменты,

деления, роста,

внеклеточ-

ные

диацилглице-

Фосфатазы

транспортеры,

миграции, диф-

ной среды.

рол, инозитол-

цитоскелет

ференцировки,

Регуляторы

3-фосфат, Са2+

функциональ-

ной активности

мембранного

потенциала.

Обратите внимание, что количество рецепторов на поверхности клетки может меняться. Это происходит вследствие: латеральной подвижности; синтеза и встраивания рецепторов в плазмолемму de novo; интернализации рецепторов после связывания с лигандом.

Обратите внимание на антигенные детерминанты, определяющие, например, группы крови и резус фактор, и расположенные в плазмолемме клеток, формируя своеобразный «паспорт». Данный феномен связан с наличием в плазмолемме рецепторов гистосовместимости (MHC) I и II класса, роль которых заключается в поддержании иммунологического гомеостаза организма, распознавании антигенов, реализации иммунных реакций. В клинической практике анализ антигенных детерминант лежит в основе иммунотипирования в трансплантологии – с целью подбора донорских органов для разных реципиентов.

При изучении функционального значения плазмолеммы обратите внимание на ее участие в изменении поверхности клетки, образовании специализированных структур

– микроворсинок (рис. 1.2.10), поддержании уникальной формы (рис. 1.2.11). Однако форма клеток может меняться, что зависит от взаимодействия с окружающими структурами (соседними клетками, межклеточным веществом) и реализуется за счет формирования различных межклеточных контактов. Рассмотрите их классификацию, строение, значние. Десмосомы формируют прочные механические связи (рис. 1.2.15); плотные контакты обеспечивают химическую изоляцию одной среды от другой (1.2.16); щелевидные соединения являются вариантом информационного обмена между клетками, обеспечи- вая возможность транспорта ионов и мессенджеров из одной клетки в другую (рис. 1.2.14).

К НАЧАЛУ ГЛАВЫ К "СОДЕРЖАНИЮ"

20				Цитология и общая эмбриология
		Предлагается для самоконтроля выполнить задания:
	Зарисуйте в альбом схему строения плазмолеммы (рис. 1.2.7), расшифруйте циф-
ровые обозначения и			заполните к ней таблицу:
				Таблица 1.2.1
		Морфофункциональная характеристика плазмолеммы
	Ñëîè	плазмолеммы	Биохимический состав	Функциональное значение

Зарисуйте в альбом схему строения межклеточных контактов (рис. 1.2.13), расшифруйте цифровые обозначения и заполните к ней таблицу:

Таблица 1.2.2

Морфофункциональная характеристика межклеточных контактов

Вид контакта	Особенности строения	Функциональное значение

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ НА ЗАНЯТИИ

Объект изучения:

I. Микропрепарат:

1.Общая морфология клетки. Печень. Окраска гематоксилином и эозином. Большое увеличение. Рис. 1.2.1. (см. КАРТУ ЗАДАНИЙ И ОРИЕНТИРОВОЧНЫХ ОСНОВ ДЕЙСТВИЯ).

КАРТА ЗАДАНИЙ И ОРИЕНТИРОВОЧНЫЕ ОСНОВЫ ДЕЙСТВИЯ

Объект	Программа			действия	Возможные ориентиры
Препарат: Печень.	Найдите		при малом
Окраска гематокси-	увеличении:
лином и эозином. Ув.	1)	клетки;			1 – многоугольные образования, которые
× 400.	Найдите		è	зарисуй-	плотно прилежат одно к другому, цитоплаз-
	òå	ïðè	большом		ма оксифильная;
	увеличении			2-3	2 – округлое, базофильно окрашенное, рас-
	клетки, а в них:				положено чаще в центре клетки;
	2)	ÿäðî;			3 – оксифильная, мелкозернистая структура,
	3)	цитоплазму;			в центре которой или эксцентрично определя-
	4)	плазмолемму.			ется круглое базофильное ядро;
					4 – оксифильная полоска, окружающая
					цитоплазму каждой клетки.
					Сравните с рис. 1.2.1.

К НАЧАЛУ ГЛАВЫ К "СОДЕРЖАНИЮ"