Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Гилберт С. Биология развития. Т.2.doc ,БИР.doc
Скачиваний:
520
Добавлен:
23.02.2015
Размер:
19.98 Mб
Скачать

Гилберт с. Биология развития: в 3-х т. Т. 2: Пер. С англ. – м.: Мир, 1994. – 235 с.

96________________ ГЛАВА 10______________________________________________________________________________

Рис. 10.21. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК. ДНК, разрезанная рестриктазой Ват HI, помещается в карман геля. В электрическом поле мелкие фрагменты движутся быстрее, чем крупные. После разделения фрагментов (на основе их размеров) гель разрезают и фрагменты ДНК элюируют для последующей гибридизации.

вые 97 аминокислот легкой цепи антитела. Второй сегмент, J-область, состоит из четырех или пяти возможных последовательностей ДНК для последних 15—17 остатков вариабельной части легкой цепи антитела. Третий сегмент определяет константную (С) область легкой цепи. В ходе развития В-лимфоцита одна из трехсот V-областей и одна из пяти J-областей комбинируются друг с другом и образуют вариабельную часть гена антитела. Это достигается перемещением последовательности V-области к последовательности J-области перестройки, которая сопровождается удалением промежуточной ДНК.

О такой перестройке гена впервые сообщалось в работе Хозуми и Тонегавы (Hozumi, Tonegawa, 1976). Эти исследователи выделили ДНК из зародышей мыши и опухолевых B-клеток, секрети-

(см. след. страницу)

Рис. 10.22. Протокол и результаты опыта Хозуми и Тонегавы. ДНК из эмбриональных клеток мыши и В-клеток по отдельности гидролизовали рестриктазой Ват HI, фракционировали с помощью электрофореза и элюировали из гелей. Каждый элюированный препарат ДНК после денатурации гибридизовали или с полной мРНК. кодирующей вариабельную и константную области легкой цепи иммуноглобулина, или с фрагментом мРНК, кодирующим только константную область легкой цепи белка (3'-конца). В случае эмбриональной ДНК вариабельная и константная области легкой цепи белка были обнаружены в двух различных фрагментах ДНК (константная область располагалась на фрагменте с молекулярной массой 3,9 х 106. а вариабельная область – на фрагменте ДНК с массой 6 х 106). В опухолевых лимфоцитах константная и вариабельная области располагались вместе на одном фрагменте ДНК, имеющем молекулярную массу 2,4 х 106. (По Hozumi, Tonegawa, 1976.)

Гилберт с. Биология развития: в 3-х т. Т. 2: Пер. С англ. – м.: Мир, 1994. – 235 с.

______________ ТОЖДЕСТВО ГЕНОМОВ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ___________________ 97

рующих легкие цепи 1. Каждый из двух препаратов ДНК обрабатывали рестриктазой BamHI, которая расщепляет в ДНК последовательность ГГАТЦЦ, где бы она ни находилась. В результате были получены серии фрагментов ДНК. Размеры каждого фрагмента определялись длиной участка ДНК между двумя сайтами расщепления.

Полученные фрагменты ДНК наносили на край желеобразного плоского геля, через который пропускали электрический ток (рис. 10.21). При миграции ДНК к положительному электроду меньшие по размеру фрагменты двигались быстрее, чем ее крупные фрагменты, за счет чего достигалось эффективное разделение фрагментов по размерам. Гель с распределенной по нему ДНК разрезали на кусочки, каждый из которых содержал фрагменты ДНК определенного размера2. Из каждого кусочка элюировали ДНК и денатурировали ее. Часть этой ДНК гибридизовали с радиоактивной РНК, которая кодирует полную легкую цепь и была изолирована из исходных опухолевых B-клеток. Другую часть гибридизовали с радиоактивной РНК, которая кодирует лишь С-область легкой цепи (фрагмент мРНК с 3'-конца). ДНК из клеток зародышей связывалась с мРНК легкой цепи в двух зонах геля. ДНК в первой зоне имела молекулярную массу около 6 млн. дальтон, тогда как ДНК во второй зоне – 3,9 млн. дальтон. При гибридизации ДНК зародышей мыши с мРНК для С-области легкой цепи эта РНК связывалась лишь с ДНК из зоны с молекулярной массой 6 млн. Таким образом, в зародышах мыши С-область кодируется внутри фрагмента ДНК с молекулярной массой 6 млн. (между сайтами BamHI). тогда как V-область кодируется внутри фрагмента с массой 3,9 млн. (рис. 10.22).

Принципиально иной результат был получен для ДНК из опухолевых лимфоцитов. Единственная зона ДНК, связывающая мРНК легкой цепи, имела молекулярную массу 2,4 млн. Кроме того, эта зона связывала фрагмент мРНК, кодирующий С-область легкой цепи. Оказалось, что обе области, С и V, кодируются одним и тем же фрагментом ДНК! Простейшее объяснение, которое было многократно подтверждено в других лабораториях и с помощью иных методов (см. Brack et al., 1978; Bernard el al., 1978; Seidman ei al., 1979), заключается в том, что два фрагмента гена, один из которых кодирует С-область легкой цепи и другой – специфичную V-область легкой цепи, соединились вместе, образовав новый ген. Новый ген возник в ходе развития лимфоцита. Предложенная авторами схема образования такого гена показана на рис. 10.23.

ФОРМИРОВАНИЕ ГЕНОВ ТЯЖЕЛЫХ ЦЕПЕЙ АНТИТЕЛ. Гены тяжелых цепей антител содержат даже боль-

1 Опухолевые клетки были использованы потому, что они синтезируют огромное количество определенного иммуноглобулина (и мРНК для этого иммуноглобулина).

2 Размер ДНК в каждом кусочке геля определяли по миграции фрагментов ДНК с известной длиной на параллельной дорожке.