Практическое занятие № 1 «Заменимые и незаменимые аминокислоты и их роль в обмене человеческого организма. Энергетическая ценность белков» Вопросы к семинарскому занятию:

1. Элементарный состав белков. Азотный баланс.

2. Классификация аминокислот, входящих в состав белков: протеиногенные, модифицированные, минорные.

3.Особенность строения протеиногенных аминокислот.

4. Нингидриновая реакция на α-аминокислоты.

5. Заменимые аминокислоты и их роль в обмене веществ.

6. Значение отдельных заменимых аминокислот в пищевой промышленности и медицине.

7. Классификация незаменимых аминокислот и их роль в обмене веществ.

8. Суточные нормы незаменимых аминокислот.

9. Значение незаменимых аминокислот в пищевой промышленности и медицине.

10. Химическая и биологическая ценность белков.

11. Сравнительная характеристика, с точки зрения полноценности, белков растительного и животного происхождения.

Лабораторная работа № 1 «Качественный и количественный анализ белков растительного и животного происхождения»

1. Качественное определение незаменимых аминокислот.

Радикалы аминокислот исключительно разнообразны. Это дает возможность использовать для обнаружения большинства аминокислот цветные реакции. Многие из них весьма чувствительны и высокоспецифичны, что позволяет открывать ничтожные количества той или иной индивидуальной аминокислоты в составе сложных смесей, биологических жидкостях, гидролизатах белков и т.п.

Некоторые цветные реакции находят применение для количественного определения аминокислот.

1) Ксантопротеиновая реакция на ароматические амнокислоты. В три пробирки вносят 3 мл раствора пищевого белка (далее везде яичный, желатина (белок коллаген), пшеничный белок) и 1 мл концентрированной азотной кислоты. Смеси осторожно нагревают до появления желтой окраски у яичного белка (время нагревания остальных реакционных смесей должно быть таким же как и для яичного белка). После охлаждения в каждую пробирку добавляют одинаковый объем 10%-ного раствора гидроксида натрия или водного раствора аммиака до появления оранжевой окраски в пробирке с яичным белком.

В ароматических аминокислотах, содержащих бензольные кольца (тирозин, триптофан, фенилаланин), под действием азотной кислоты происходит реакция нитрования бензольного кольца с образованием окрашенного в желтый цвет нитросоединения. Изменение желтой окраски в оранжевую в щелочной среде обусловлено появлением хромофорной группы.

2) Реакция Миллона на тирозин. В три пробирки к 1 мл соответствующего пищевого белка прибавляют 5 мл 2,5%-ного раствора серной кислоты и перемешивают до полного растворения. Приливают 1 мл реактива Миллона, встряхивают и оставляют стоять при комнатной температуре. Через некоторое время раствор окрашивается в кроваво-красный цвет. Для ускорения появления окраски раствор можно слегка подогреть.

Реактив Миллона представляет собой смесь нитратов и нитритов оксида ртути (І) и (ІІ), растворенных в концентрированной азотной кислоте. При взаимодействии его с фенольным ядром тирозина возникает нитрозотирозин, ртутное соединение которого окрашено в красный цвет при достаточном количестве этой аминокислоты в пищевом белке.

3) Реакция Сакагучи на аргинин. В три пробирки наливают 2 мл пищевого белка, прибавляют 2 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия и несколько капель 0,2%-ного спиртового раствораα-нафтола. Хорошо перемешивают содержимое пробирки, приливают 0,5 мл раствора гипобромита натрия и вновь перемешивают. Немедленно добавляют 1 мл 40%-ного раствора мочевины для стабилизации быстро развивающегося оранжево-красного окрашивания при наличии в белке достаточного количества аргинина.

4) Реакция Паули на гистидин и тирозин. К 1 мл 1%-ного раствора сульфаниловой кислоты в 5%-ном растворе соляной кислоты прибавляют 2 мл 0,5%-ного раствора нитрита натрия, сильно встряхивают и немедленно приливают сначала 2 мл пищевого белка, а затем, после перемешивания содержимого пробирки, 6 мл 10%-ного раствора карбоната натрия. При наличии достаточного количества гистидина в белке развивается интенсивная вишнево-красная окраска.

При взаимодействии кислого раствора сульфаниловой кислоты с нитритом натрия осуществляется реакция диазотирования и образуется диазобензолсульфоновая кислота. При реакции последней с гистидином образуется азосоединение вишнево-красного цвета.

5) Реакции на триптофан. Реакция Адамкевича. К 0,5 мл пищевого белка добавляют 0,5 мл ледяной уксусной кислоты, которая всегда содержит небольшое количество глиоксиловой кислоты. Полученную смесь вначале нагревают, а затем охлаждают и по стенке пробирки осторожно, по каплям, чтобы жидкости не смешивались, добавляют 1 мл концентрированной серной кислоты. Через 10 минут на границе раздела двух слоев наблюдается образование красно-фиолетового кольца при достаточном количестве триптофана в белке. Реакцию можно ускорить, поместив пробирку с реагирующей смесью в кипящую водяную баню.

Триптофан в кислой среде вступает в реакцию с глиоксиловой кислотой (альдегидами), образуя при этом окрашенные в красно-фиолетовый цвет продукты конденсации.

6) Реакции на триптофан. Реакция Вуазене.К 2 мл пищевого белка добавляют одну каплю 2,5%-ного раствора формальдегида, смесь перемешивают и вливают порциями по несколько капель 6 мл концентрированной серной кислоты, охлаждая пробирку в ванночке со льдом. Смесь опять перемешивают и дают отстояться 10 минут. В дальнейшем при перемешивании в пробирку вносят 10 капель 0,5%-ного раствора нитрита натрия. Возникает интенсивная сине-фиолетовая окраска при достаточном количестве триптофана в белке.

7) Реакция Фоля на «слабосвязанную» серу цистеина и цистина. В пробирку вносят 1 мл пищевого белка, 2 мл концентрированного раствора гидроксида натрия и 0,5 мл 10%-ного раствора ацетата свинца. Смесь тщательно перемешивают и кипятят на водяной бане 2 минуты. Через 3-5 минут выпадает бурый или черный осадок сульфида свинца при наличии в белке достаточного количества цистеина и цистина.

При кипячении цистеина и цистина в щелочной среде от них легко отщепляется сера в виде сульфид-иона. Для выявления сульфид-иона можно использовать ацетат свинца, который при взаимодействии с гидроксидом натрия образует плюмбит натрия. В свою очередь плюмбит натрия, реагируя с сульфид-ионом (из сульфида натрия), приводит к образованию сульфида свинца черного цвета.

Таблица

Белок	Наблюдения	Интен-сивность окраски
1) Ксантопротеиновая реакция на ароматические амнокислоты
Яичный белок
Желатина
Белок пшеницы
2) Реакция Миллона на тирозин
Яичный белок
Желатина
Белок пшеницы
3) Реакция Сакагучи на аргинин
Яичный белок
Желатина
Белок пшеницы
4) Реакция Паули на гистидин и тирозин
Яичный белок
Желатина
Белок пшеницы
5) Реакции на триптофан. Реакция Адамкевича
Яичный белок
Желатина
Белок пшеницы
6) Реакции на триптофан. Реакция Вуазене
Яичный белок
Желатина
Белок пшеницы
7) Реакция Фоля на «слабосвязанную» серу цистеина и цистина
Яичный белок
Желатина
Белок пшеницы

- не окрашено

+ слабая окраска

++ окраска средней интенсивности

+++ интенсивная окраска

Выводы:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________