Практическое занятие № 2 «Классификация ферментов; строение коферментов и простетических групп их каталитических центров» Вопросы к семинарскому занятию:

1. Роль ферментов в организме.

2. Строение ферментов и их активных центров.

3. Свойства ферментов.

4. Влияние физических и химических факторов на активность ферментов.

5. Специфичность действия ферментов. Виды специфичности.

6. Номенклатура и классификация ферментов.

7. Классы ферментов.

8. Процессы пищевых производств, которые основаны на действии ферментов.

9. Ферменты консервной промышленности.

10. Ферменты мясоперерабатывающей промышленности.

11. Ферменты крахмалопатоковой промышленности.

Лабораторная работа № 2 «Изучение механизма действия витаминзависимых ферментов на примере оксидоредуктаз»

Присутствие окислительно-восстановительных ферментов в растительных и животных тканях и биологических жидкостях может быть обнаружено по их действию на соответствующие субстраты.

Задание 1. Окисление тирозина молекулярным кислород в присутствии тирозиназы (катехолоксидазы).Тирозиназа относится к группе оксидаз и катализирует окисление одноатомных и многоатомных фенолов (орто-дифенолы) и родственных им соединений (групповая специфичность) кислородом воздуха. По химической природе тирозиназа является металлопротеидом, содержащим медь в количестве 0,20-0,25%. Медь является необходимым компонентом активного центра фермента и действует как переносчик электронов в процессе окисления и восстановления. Тирозиназа находится в отдельных тканях и органах и широко распространена в растениях и грибах.

В организме животных и человека тирозиназа катализирует превращение адреналина в физиологически неактивный пигмент адренохром. Последний, конденсируясь, превращается в бурый пигмент меланин. Бронзовый цвет кожи при заболевании надпочечников (аддисонова болезнь) обусловлен образованием избыточного количества меланина.

Ход работы. Мелкоизмельченный картофель в количестве 0,5-1 г растирают в фарфоровой ступке с 3 мл дистиллированной воды и фильтруют через два слоя марли. Фильтрат содержит фермент тирозиназу.

В две пробирки наливают по 1 мл вытяжки из картофеля, содержащей фермент тирозиназу. Содержимое одной пробирки кипятят 1-2 минуты и охлаждают в стакане с холодной водой. В обе пробирки добавляют по 0,5 мл насыщенного раствора тирозина, перемешивают и помещают в водяную баню при температуре 40-45 ^оС. Каждые 5 минут пробирки вынимают и содержимое их сильно встряхивают для лучшего соприкосновения жидкости в пробирках с воздухом. Жидкость в пробирке с активным ферментом постепенно принимает сначала розовую, красную, а через 1-2 часа – бурую и черную окраску. В контрольной пробе с прокипяченной вытяжкой цвет жидкости не изменяется (почему?).

Реакция обусловлена окислением тирозина кислородом воздуха и протекает благодаря каталитическому действию тирозиназы. В процессе окисления из тирозина образуется красный пигмент галахром, который затем превращается в темный пигмент, родственный естественным меланинам.

Задание 2. Окисление формальдегида метиленовой синью в присутствии альдегиддегидрогеназы (ксантиноксидазы) молока. Альдегиддегидрогеназа, или ксантиноксидаза, относится к аэробным дегидрогеназам (акцептором электронов и протонов служит кислород) и катализирует окисление гидратированной формы гипоксантина в ксантин, а также ксантина в мочевую кислоту. По химической природе ксантиноксидаза является флавопротеидом, содержащим металл молибден. В отличие от оксидаз геминовой природы (цитохромоксидаза) и тирозиназы, катализирующих окисление субстрата молекулярным кислородом с образованием молекул воды, при действии на субстрат оксидаз флавиновой природы конечным продуктом реакции является перекись водорода.

При определенных условиях альдегиддегидрогеназа может передавать электроны не только кислороду воздуха, но и цитохромной системе. В анаэробных условиях фермент способен окислять субстрат за счет восстановления метиленовой сини и других красок, например, индиго, индофенола и др.

Ксантиноксидаза содержится в молоке, печени, а также в других тканях растительного и животного происхождения.

Ход работы. В две пробирки наливают по 1 мл свежего молока, в третью – прокипяченного и охлажденного молока. В первую и третью пробирки добавляют по 1 капле смеси 0,4%-ного раствора формальдегида и 0,02%-ного раствора метиленовой сини, во вторую – 1 каплю 0,02%-ного водного раствора метиленовой сини. Жидкость во всех трех пробирках должна быть окрашена одинаково в негустой голубой цвет. Во все три пробирки добавляют по 5 капель вазелинового масла для предохранения жидкости от соприкосновения с кислородом воздуха (создание анаэробных условий) и помещают в водяную баню при температуре 40^оС. Через некоторое время жидкость в первой пробирке обесцвечивается.

Реакция обусловлена восстановлением метиленовой сини в лейкоформу за счет окисления формальдегида в муравьиную кислоту и протекает благодаря каталитическому действию фермента альдегиддегидрогеназы.

Вследствие отсутствия активного фермента в прокипяченной пробе (третья пробирка) и субстрата в одной из некипяченых проб (вторая пробирка) обесцвечивания метиленового синего не происходит. Реакцией на альдегиддегидрогеназу можно отличить сырое молоко от кипяченого.

Задание 3. Окисление пирогаллола перекисью водорода в присутствии пероксидазы. Пероксидазами называются ферменты, которые катализируют окисление некоторых фенолов, полифенолов и ароматических аминов перекисью водорода или органическими перекисями.

Участвующая в реакции перекись водорода образуется в организме в результате действия некоторых оксидаз флавиновой природы (ксантиноксидаза). Органические перекиси возникают при окислении кислородом воздуха легко окисляющихся веществ, например, терпенов, каротиноидов и непредельных жирных кислот.

По химической природе пероксидаза является геминовым ферментом (в состав простетической группы входит железопорфирин) и содержит одну гематиновую (Fe³⁺) группу на молекулу фермента. Пероксидаза широко распространена почти во всех растительных клетках. В организме человека и животных слабой пероксидазной активностью обладает гемоглобин, миоглобин, цитохромы.

Ход работы. В четыре пронумерованные пробирки наливают по 0,5 мл 2%-ного водного раствора пирогаллола и добавляют: в первую – 0,5 мл свежей вытяжки из хрена (содержит фермент пероксидазу) и 2 капли 1%-ного раствора перекиси водорода, во вторую – 0,5 мл прокипяченной и охлажденной вытяжки из хрена и 2 капли 1%-ного раствора перекиси водорода, в третью – 0,5 мл дистиллированной воды и 2 капли 1%-ного раствора перекиси водорода, в четвертую – 0,5 мл свежей вытяжки из хрена. Содержимое всех пробирок взбалтывают и наблюдают, что красный (возможно желто-бурый) осадок пурпургаллина образуется только в той пробирке (первая пробирка), где присутствуют донатор (пирогаллол) и акцептор водорода (перекись водорода) и активный фермент – пероксидаза.

Реакция обусловлена окислением пирогаллола перекисью водорода с образованием пурпургаллина – нерастворимого вещества красного цвета.

Задание 4. Разложение перекиси водорода каталазой крови. Каталаза катализирует разложение перекиси водорода на молекулярный кислород и воду. При этом одна молекула перекиси водорода окисляется и служит донором электронов, а другая восстанавливается и является акцептором электронов.

По химической природе каталаза является геминовым ферментом и содержит четыре гематиновые группы на молекулу фермента. Каталаза содержится во всех тканях и жидкостях организма, в большом количестве находится в эритроцитах. Биологическая роль каталазы заключается в обезвреживании перекиси водорода путем разрушения ее на воду и молекулярный кислород. Следует отметить, что если перекись водорода не удаляется из сферы окислительно-восстановительной реакции, то действие флавиновых оксидаз прекращается. В разрушении перекиси водорода принимает участие и пероксидаза.

Ход работы. В пробирку наливают 0,5 мл 1%-ного раствора перекиси водорода и добавляют 1 каплю крови. Происходит бурное выделение кислорода: жидкость вспенивается, и пена заполняет всю пробирку.

Таблица

Окислительно-восстановительные ферменты

Название фермента	Химическая природа простети-ческой группы	Биологи-ческий материал, содержащий фермент	Окисляющееся вещество (донатор водорода)	Восстанав-ливающееся вещество (акцептор водорода)	Продукты реакции и их окраска

Выводы:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________