Sivolob_A_V__Afanasyeva_K_S_Molekulyarna_organ

Дисоціація N- та С- кінцевих доменів

SMC2-SMC4

N

C C

N

Гідроліз АТР

					221
N
C		C			Зв’язування АТР
		N
				N
						C
				C
						N
N					Взаємодія N- та С-
C		C			кінцевих доменів
		N			SMC2-SMC4

Рис. 6.5. Цикл зв’язування та гідролізу АТР в роботі конденсинів.

Мікроманіпуляції за допомогою магнітного пінцета з лінійними молекулами ДНК, зв'язаними з одним конденсиновим комплексом, дозволяють оцінити рівень компактизації ДНК, що ним забезпечується. З’ясувалося, що один конденсиновий комплекс створює два супервитки розміром 30 нм (~90 пар основ) кожен, таким чином компактизуючи ДНК на 60 нм (рис. 6.6). Ці оцінки співпадають з даними електронної мікроскопії, які демонструють, що один комплекс взаємодіє з ділянкою ДНК довжиною приблизно 65 нм.

222

ДНК

C N C N

Рис. 6.6. Одна з можливих схем взаємодії конденсинового комплексу з двома позитивними надспіральними витками ДНК (для спрощення рисунка білки САР не наведено).

Отже, як і топоізомераза ІІ, конденсини здатні змінювати топологію циркулярних молекул ДНК. Яким чином ці два драйвери топологічного стану хроматину приймають участь у компактизації хромосом і як скоординована робота цих білків під час утворення мітотичної хромосоми? Відповіді на ці запитання суперечливі і мають здебільшого характер спорадичних експериментальних фактів, на основі яких можна зробити лише ряд припущень. Існують, зокрема, розбіжності у баченні того, навколо якого елементу білків SMC (домену coiled coil чи глобулярних доменів) формуються надспіральні витки, та залишається суперечливим питання, чи взаємодіють конденсини з хроматином у вигляді V- подібної чи замкненої конфігурації. Деякі можливі сценарії участі конденсинів у компактизації ДНК і підтриманні структури хромосоми розглядатимуться у наступних підрозділах. Але будь-які сценарії мають узгоджуватись з тим, що компактизація ДНК на ранніх стадіях мітозу забезпечується топоізомеразою ІІ та конденсинами ІІ типу. В кінці профази, коли відбувається розрив ядерної оболонки, з хроматином взаємодіють цитоплазматичні

223

конденсини І типу, що призводить до додаткового ущільнення хромосоми.

6.1.5. Когезини. Основу когезинового комплексу складає гетеродимер білків SMC1 та SMC3, які мають структуру, характерну для інших білків родини SMC (див. рис. 6.2). Структура гетеродимера, у свою чергу, аналогічна структурі димера SMC2 та SMC4 у складі конденсинів. Крім білків SMC до складу когезинів входять також два інші білки – Scc1 та Scc3. У складі когезинового комплексу Scc1, що відноситься до родини клейзинів, зв'язується з обома типами білків SMC: своєю N-кінцевою частиною він взаємодіє з глобулярним доменом SMC3, а С-кінцевою – з глобулярним доменом SMC1 (рис. 6.7). Фактично, Scc1 у складі когезинів виконує роль, аналогічну такої білків САР-Н/САР-Н2 конденсинів. На відміну від конденсинів, когезиновий комплекс має під електронним мікроскопом форму замкненого чи відкритого кільця: взаємна орієнтація шарнірних доменів зумовлює розходження плечей coiled coil у різні боки, а при замиканні структури у межах плечей здійснюється кілька різких вигинів. Внутрішній діаметр такої кільцеподібної структури становить приблизно 50 нм. Цю структуру додатково стабілізує білок Scc3 (два його гомологи у ссавців позначаються також як SА1 та SА2 – до складу когезинового комплексу входить лише якийсь один з них). Чотири білки – SMC1, SMC3, Scc1 та Scc3 – є основою когезинів, проте, крім них до складу комплексу можуть входити й інші білки, функції яких остаточно не з’ясовані.

224

Шарнірний домен

SMC 3	SMC 1
Домен coiled
coil
N	C
C	N
Scc1	Scc3

Рис. 6.7. Схема структури когезинового комплексу.

Численні експерименти як in vitro, так і in vivo, свідчать про низьку спорідненість когезинів до ДНК і підтверджують модель, згідно якої когезини оточують ДНК кільцем, утримуючи таким чином поруч дві сестринські хроматиди (рис. 6.8, а). В літературі також обговорюються й інші моделі, які, не заперечуючи кільцевої топологічної взаємодії когезинів з ДНК, передбачають димеризацію або олігомеризацію комплексів (рис.

6.8, б, в).

225

а

б

в

Рис. 6.8. Моделі взаємодії когезинів з ДНК: модель кільця (а), модель наручників (б), модель браслета (в).

У дріжджів, що брунькуються (S. cerevisiae), завантаження когезинів на ДНК розпочинається наприкінці G1-фази клітинного циклу, у той час як у хребетних вони наявні на хроматині вже у пізній телофазі в момент утворення ядерної оболонки (наприкінці попереднього циклу). Тобто, в обох випадках, реплікація ДНК відбувається у присутності когезинів: діаметр кільця, що утворюють когезинові комплекси, є достатнім для безперешкодного проходження машинерії реплікації. Посадка когезинів на хроматин здійснюється за допомогою комплексу білків Scc2 та Scc4, який взаємодіє як з ДНК, так і з когезинами. Припускають, що Scc2 та Scc4 стимулюють АТРазну активність N- та C-кінцевих глобулярних доменів білків SMC, що призводить до конформаційних перебудов комплексу. При цьому спостерігається часткове розкриття когезинів в межах шарнірних доменів білків SMC – між ними порушуються взаємодії. Подальше зв’язування АТР знову закриває комплекс, але вже після захоплення всередину молекули ДНК.

226

Когезини зв’язуються з хроматиновою фібрилою по всій

їїдовжині (сайт взаємодії займає ~800 пар основ ДНК) на відстані приблизно 10 тис. пар основ один від одного. Аналіз розташування когезинів на хроматині виявив, що вони зосереджені в основному в АТ-збагачених міжгенних районах (у дріжджів та ссавців), в транскрипційно активних ділянках та зонах ориджинів реплікації (у дрозофіли), а також можуть розміщуватися в інтронах (у людини). Доволі цікавим є той факт, що сайти розміщення когезинів можуть не співпадати з сайтами взаємодії з ДНК їх завантажувачів – білків Scc2 та Scc4. Припускають, що когезини зсуваються вздовж ДНК РНКполімеразними комплексами під час транскрипції.

Надкомпактизація сестринських хроматид є несумісною з наявністю когезинових комплексів, що утримують ці хроматиди разом по усій довжині. Відповідно, у ранній профазі за рахунок дисоціації когезинових комплексів з плечей хромосом відбувається порушення зв'язку між хроматидами скрізь, крім центромерних зон – сестринські хромосоми, які продовжують компактизуватись, залишаються з'єднаними когезиновими комплексами тільки своїми центромерами.

Ключовими білками, що забезпечують звільнення когезинів з плечей хромосом, є дві кінази – Plk-1 та Aurora B. За рахунок активності Plk-1 у профазі спостерігається гіперфосфорилювання білків Scc1 та Scc3, що зумовлює розкриття когезинів та їх дисоціацію з хроматину (рис. 6.9). В експериментах in vitro було показано, що кіназа Aurora B безпосередньо не модифікує жодної складової когезинів, проте

їїактивність є необхідною для їхньої дисоціації. Припускають, що фосфорилювання інших хромосомних білків-мішеней цією кіназою (зокрема, конденсинів І типу) опосередковано стимулює від'єднання когезинів. Отже, процес видалення когезинів тісно узгоджений із компактизацією хромосом у профазі.

227

Фосфорилювання Scc1 та Scc3 на плечах хромосом

Центромера

Plk	Розкриття когезинів на плечах
	хромосом з подальшою їх дисоціацією

Aurora

Рис. 6.9. Дисоціація когезинів з плечей хромосом. Зірочкою позначені залишки фосфорної кислоти.

Слід підкреслити, що при масованому видаленні когезинів у профазі вони, проте, не звільняються із центромерних районів, оскільки захищені в цих ділянках від деструктивної дії фосфорилювання білком Sgo1. Цей білок специфічно локалізується лише в центромері і рекрутується туди гетерохроматиновим білком НР1 та деякими центромерними білками. Акумулювання Sgo1 в центромері забезпечує зв'язування з цією ділянкою протеїн-фосфатази 2А, яка відщеплює з когезинів приєднані кіназами фосфатні залишки, тим самим роблячи дисоціацію неможливою.

6.2. Іонні взаємодії у мітотичній хромосомі

228

Основною частиною хромосоми (приблизно третина маси) є високозаряджена молекула ДНК. Беручи до уваги сумарний заряд гістонів (загальна маса яких приблизно дорівнює масі ДНК), вони здатні нейтралізувати негативні заряди на фосфатних залишках приблизно на 50 % – загальний баланс заряду в хроматині залишається негативним. Решта фосфатних залишків нейтралізується негістоновими білками та, головним чином, неорганічними катіонами. При цьому ефективність електростатичних білково-нуклеїнових взаємодії суттєво залежить від концентрації неорганічних катіонів – знижується при зростанні іонної сили розчину. Тобто, необхідний для компактизації ДНК високий рівень нейтралізації її негативного заряду вимагає тонкого балансу нейтралізуючих агентів: концентрація неорганічних катіонів повинна бути достатньо високою, щоб забезпечити нейтралізацію, але при цьому достатньо низькою, щоб ефективність нейтралізації за рахунок білків також залишалась на високому рівні. Відповідно, електростатичні взаємодії та неорганічні катіони як їх модулятори (і важливі нейтралізатори негативного заряду ДНК) суттєво впливають на рівень конденсації і інтерфазного хроматину (підрозділ 4.2), і мітотичної хромосоми.

Результати дослідження розподілу неорганічних катіонів у клітині методами масс-спектрометрії 3D (так звана іонна мікроскопія) свідчать, що концентрація K+ (як відомо, основний одновалентний катіон всередині клітини) є підвищеною в інтерфазному ядрі у порівнянні з цитоплазмою. З огляду на високий сумарний негативний заряд хроматину це є цілком очікуваним. Аналогічно розподілені по клітині іони Na+, загальна кількість яких є значно меншою. При переході клітини до мітозу перерозподілу одновалентних катіонів не спостерігається – обидва катіони залишаються асоційованими з мітотичними хромосомами.

Більш цікаво поводять себе двохвалентні катіони. В інтерфазі Mg2+ і Ca2+ розподілені по клітині більш-менш рівномірно (концентруючись у певних компартментах), без особливої різниці між ядром та цитоплазмою. Загальна внутрішньоклітинна концентрація дорівнює ~2 мМ для Mg2+ і ~8

229

мМ для Ca2+. В мітозі загальна концентрація Mg2+ не змінюється, а Ca2+ – знижується у ~1,3 рази. При цьому спостерігається суттєвий перерозподіл двохвалентних катіонів та підвищення рівня їхньої асоціації з хромосомами. Оцінки свідчать, що щільність зв'язування становить один іон Ca2+ на кожні 12–20 нуклеотидів ДНК і один іон Mg2+ на кожні 20–30 нуклеотидів. Якщо іони Mg2+ розподілені по мітотичній хромосомі більш-менш дифузно, Ca2+ концентрується в аксіальній частині – практично так само, як топоізомераза ІІ та конденсини ІІ. Відношення Ca2+/Mg2+ в аксіальній частині хромосоми оцінюється як 3:1.

Підвищення рівня асоціації двохвалентних катіонів з мітотичними хромосомами є, найімовірніше, просто неспецифічним наслідком підвищення рівня компактизації, тобто зростання локальної концентрації фосфатів ДНК. При цьому адсорбція катіонів на конденсованій ДНК, у свою чергу, приводить до суттєвої стабілізації компактного стану. Додаткове накопичення Ca2+ в аксіальній частині зумовлено присутністю там топоізомерази ІІ – показана пряма взаємодія Ca2+ з цим ферментом. Важливо при цьому, що Ca2+ є інгібітором топоізомерази ІІ, зупиняючи реакцію, зображену на рис. 6.1, на стадії дволанцюгового розриву. При співвідношенні 3:1 між Ca2+ та Mg2+ in vitro активність топоізомерази ІІ повністю блокується: таким чином, накопичення Ca2+ в аксіальній частині хромосоми зумовлює вимикання активності топоізомерази ІІ при високих рівнях компактизації. Можливо, це є засобом загальмувати активність (яка була необхідною на ранніх етапах компактизації) та "законсервувати" фермент до стадії декомпактизації, де така активність знадобиться знову (див. наступний підрозділ). З іншого боку, блокування каталітичної активності дозволяє припустити структурну роль топоізомерази ІІ – інактивований фермент перетворюється у ДНК-зв'язувальний білок, який фіксує перехрещені ділянки ДНК. Стає також цілком зрозумілою згадана у підпідрозд. 6.1.2 відсутність впливу інгібіторів топоізомерази ІІ на морфологію хромосоми у пізній профазі – топоізомераза ІІ і так є заінгібованою на цій стадії за рахунок іонів Ca2+.

230

Видалення обох двохвалентних катіонів з мітотичної хромосоми хелатними сполуками призводить до її часткової деконденсації, а також до дисоціації значної частини топоізомерази ІІ та конденсинів ІІ. Підвищення концентрації Mg2+ у дослідах in vitro до 10 мМ, навпаки, викликає зростання рівня компактизації у порівнянні з нативним станом мітотичної хромосоми. У 100 мМ Mg2+ хромосома декомпактизується внаслідок послаблення ДНК-білкових електростатичних взаємодій.

Аналогічно, рівень компактизації хромосоми суттєво змінюється при змінах концентрації одновалентних катіонів in vitro (при цьому зміни морфології хромосоми є оборотними – відновлення фізіологічної концентрації солі повертає хромосому до вихідного стану). Найбільший рівень компактизації хромосоми спостерігається у розчинах з концентрацією одновалентних катіонів, близькою до фізіологічної (~100 мМ). Зниження концентрації викликає деконденсацію внаслідок зниження ступеня нейтралізації зарядів ДНК і, відповідно, зростання електростатичних сил розштовхування – аналогічний ефект є також добре відомим для інтерфазної хроматинової фібрили. Підвищення концентрації одновалентних катіонів також декомпактизує хромосому (у 400 мМ NaCl об'єм хромосоми, наприклад, тритона зростає у ~5 разів) за рахунок зниження ефективності білково-нуклеїнових електростатичних взаємодій. Всі зміни об'єму при змінах концентрації солі є ізотропними – довжина змінюється у стільки ж разів, що й товщина.

Важливо розуміти, що надкомпактний стан нативної мітотичної хромосоми зовсім не є максимально можливим компактним станом. Проста оцінка показує, що хроматинова фібрила діаметром 30 нм, до складу якої входить молекула ДНК довжиною 5 см, має об'єм ~0,5 мкм3 (за умови ступеня компактизації фібрили 11 нуклеосом на 11 нм довжини при нуклеосомному повторі 200 пар основ). Якщо б у мітотичній хромосомі реалізувалась щільна упаковка такої фібрили, хромосома повинна була б мати такий самий об'єм. Насправді середній об'єм мітотичної хромосоми є приблизно на порядок