Sivolob_A_V__Afanasyeva_K_S_Molekulyarna_organ

231

вищим. Відповідно, додавання до хромосом in vitro тривалентних катіонів (ефективних нейтралізаторів зарядів ДНК) дозволяє знизити об'єм хромосоми втричі.

Отже, хроматинова фібрила в мітотичній хромосомі компактизована за рахунок доволі слабких ДНК-білкових електростатичних взаємодій, які можуть бути легко зруйновані шляхом змін іонного оточення. При цьому основна частина об'єму мітотичної хромосоми заповнена просто водою та розчиненими в ній неорганічними іонами. Інакше кажучи, хромосома являє собою об'єкт, який нагадує гель – полімерну сітку, пори якої заповнені розчинником. Таке уявлення повністю підтверджується експериментами по вивченню механічних властивостей мітотичних хромосом.

6.3. Механічні властивості мітотичної хромосоми

У дослідженнях механічних властивостей ізольовану хромосому жорстко фіксують обома кінцями за допомогою мікропіпеток і поступово розтягують, визначаючи ступінь повздовжньої деформації та величину розтягувальної сили, необхідної для такої деформації. З’ясувалося, що мітотична хромосома характеризується неабиякою еластичністю: вона легко повертається до своєї нормальної довжини навіть після п'ятикратного розтягування, а незворотна зміна структури хромосоми спостерігається лише при більш сильній її деформацій. При розтягуванні в 10 і більше разів еластичність порушується: хромосоми зберігають збільшену довжину після зникнення розтягувальної сили, при цьому зростає також їхня товщина, що свідчить про декомпактизацію.

Рівень еластичності мітотичної хромосоми є суттєво вищим у порівнянні з таким молекул, з яких вона складається. Коефіцієнт поздовжньої пружності (сила, необхідна для збільшення довжини вдвічі) становить для мітотичної хромосоми в середньому ~500 пН (піконьютон; для індивідуальних хромосом має місце розподіл цієї величини від 200 до 2000 пН). Відповідний модуль Юнга (відношення коефіцієнта пружності до площі поперечного перетину), який, власне, і характеризує

232

еластичність того чи іншого матеріалу, дорівнює ~500 Па (паскаль, 1 Па = 1 Н/м2). Для порівняння: модуль Юнга агарозного геля становить ~104 Па, металів – ~10 10 Па. Подвійна спіраль ДНК має модуль Юнга ~3·108 Па (величинами того ж порядку характеризуються глобулярні білки). Модуль Юнга хроматинової фібрили 30 нм дорівнює ~104 Па (якщо при розтягуванні фібрили порушується її компактний стан, але зберігається нуклеосомна структура) – це означає, що при застосуванні сили 500 пН фібрила як така практично не розтягується. Тобто, фібрила організована в мітотичній хромосомі у певні клубко-подібні структури, які швидко повертаються до вихідного стану при зникненні розтягувальної сили. При цьому еластичність нативної мітотичної хромосоми щодо вигину цілком узгоджується з наведеним вище рівнем еластичності щодо розтягування – це означає, що матеріал, з якого побудована хромосома, є достатньо гомогенним.

Отже, загалом поведінка хромосоми у відповідь на деформацію зовнішньою силою є цілком подібною до такої полімерних матеріалів. Найпростішою інтерпретацією цих результатів є те, що мітотична хромосома являє собою утворену хроматиновою фібрилою сітку, елементи якої знаходяться у стані клубка; у вузлах сітки знаходяться зшивки, що з'єднують вузли нековалентими взаємодіями (рис. 6.10). Найбільш імовірні кандидати на роль таких зшивок – конденсинові комплекси.

Конденсинові

комплекси

Вузли

Фібрила 30 нм

233

Рис. 6.10. Хроматинова сітка, скріплена конденсиновими комплексами та перехрещеннями (вузлами) хроматинової

фібрили.

Така інтерпретація підтверджується рядом встановлених в експериментах по розтяганню хромосом закономірностей. Зокрема, значне зниження або навіть зникнення еластичності спостерігається при обробці хромосоми неспецифічними нуклеазами – цілісність хромосомної молекули ДНК є необхідною умовою для високої пластичності. При обробці рестриктазами зниження пластичності спостерігається в тому випадку, коли середня відстань між рестриктними сайтами є меншою порогової величини – 15 тис пар основ. Отже, середня відстань між зшивками по ланцюгу фібрили становить приблизно 15 тис пар основ, що приблизно співпадає зі щільністю розміщення конденсинів на хроматині.

М'яка обробка хромосоми протеазами призводить до часткової деконденсації та зниження жорсткості (константа пружності зменшується на 20–50 %), але еластичність не зникає повністю. Роль нечутливих до протеаз додаткових скріплюючих елементів можуть відігравати перехрещення (вузли) між ділянками ДНК – топологічні зшивки (рис. 6.10). Підтвердженням важливої ролі таких перехрещень є результати експериментів, в яких мітотичну хромосому обробляли in vitro надлишком топоізомерази ІІ у присутності АТР. В результаті такої обробки жорсткість хромосоми щодо розтягання знижується на 35 %, і цей ефект не спостерігається у відсутності АТР. Додавання АТР до нативної хромосоми також призводить до релаксації, хоча й значно меншої: напевно, відбувається часткова активація ендогенної топоізомерази ІІ, інактивованої іонами Ca2+ всередині хромосоми. Обробка хромосоми топоізомеразою І, здатною тільки знімати надспіралізацію внаслідок внесення тимчасових одноланцюгових розривів, призводить до лише незначного зниження жорсткості. Тобто, вплив активності топоізомерази ІІ на еластичні властивості хромосоми пояснюється не просто релаксацією надспіралізації, а розділенням топологічних зшивок між ділянками ДНК.

234

Отже, топологічні зшивки, "заморожені" завдяки інактивації топоізомеази ІІ іонами Ca2+, дають суттєвий внесок у стабілізацію хроматинової сітки всередині мітотичної хромосоми. У процесі декомпактизації хромосом наприкінці мітозу ці зшивки мають бути розділені – зрозуміло, що це залежить від топоізомерази ІІ, яка знову стає активною після дисоціації Ca2+.

Слід зауважити, що описані вище закономірності базуються, в основному, на результатах, отриманих групою Марко (John Marko) на хромосомах, виділених з клітин тритона (ці хромосоми відрізняються досить великим розміром, що робить їх зручним об'єктом мікромеханічних досліджень). Основні висновки, зроблені цією групою, підтверджуються також ранніми дослідженнями мікромеханіки мейотичних хромосом всередині клітин коника. Групою Дімітрова (Stefan Dimitrov) проведено аналогічні мікромеханічні дослідження на хромосомах, реконструйованих у екстрактах яйцеклітин шпроцевої жаби Xenopus laevis. Ці хромосоми, як і хромосоми тритона, характеризуються модулем Юнга ~1000 Па, але відрізняються значно вищою гнучкістю (зниженою жорсткістю щодо вигину). Це означає, що хромосоми не є гомогенними: результати механічних досліджень свідчать про наявність всередині цих хромосом достатньо тонких та більш жорстких структур, побудованих з конденсинових комплексів, оточених "м'якою" хроматиновою сіткою. Цілком можливо, що мітотичні хромосоми ембріональних клітин, які швидко діляться, проходячи через порівняно короткі клітинні цикли (яйцеклітини Xenopus), відрізняються певною "недокомпактизованістю" у порівнянні з хромосомами звичайних соматичних клітин.

У будь-якому разі, уявлення про мітотичну хромосому як хроматинову сітку, відображаючи суттєві риси внутрішньої організації хромосоми, є при цьому дещо спрощеним. Головна добре відома риса організації хромосоми, яку не пояснює проста модель сітки, – аксіальне розміщення конденсинів та топоізомерази ІІ у хромосомі.

6.4. Моделі структури мітотичної хромосоми

235

Найбільш розповсюдженим поглядом на структуру мітотичної хромосоми, який, в основному, базується на результатах електронної мікроскопії, була до останніх років класична модель радіальних петель, закріплених на скефолді

(radial loops and scaffold model). Термін "скефолд" – білковий осьовий остов мітотичної хромосоми – був запропонований наприкінці 1970-х років Леммлі (Ulrich Laemmli) на підставі спостережень, що після видалення з хромосом гістонів та більшості інших білків (наприклад, у високосольових розчинах) ДНК утворює гало, випетлюючись із електроннощільної осьової структури діаметром приблизно 200 нм (рис. 6.11). Ця структура зберігає характерну X- або V-подібну морфологію пари сестринських мітотичних хромосом. Основи петель, закріплені на цьому хромосомному "скелеті" (які зберігають такий зв'язок навіть після обробки концентрованими розчинами солі), отримали назву скефолд-асоційованих ділянок (SARs – S caffold

Associated Regions).

236

Рис. 6.11. Електронна мікрофотографія хромосоми після видалення гістонів високосольовим розчином. Репродуковано з роботи Paulson, Laemmli (1977) з дозволу

Уявлення про осьову скелетну основу мітотичної хромосоми відіграло важливу роль своєрідного змістовного "скефолду" – стрижня, навкруг якого вибудовувались дослідження структури мітотичної хромосоми в останні десятиліття. Це уявлення зберігає свою популярність і сьогодні, хоча його вже не можна назвати загальноприйнятим – не виключено, що суцільний скефолд виникає як артефакт унаслідок процедур обробки хромосоми при видаленні гістонів або фіксації препаратів. Слід

237

відразу зауважити, що скефолд на рис. 6.11 не є насправді монолітним.

Згідно моделі радіальних петель та її модифікації – моделі

спірально закручених радіальних петель (helical coiling of radial loops model), – хромосома являє собою зібрані разом та компактизовані петлі хроматинової фібрили 30 нм, основи яких зафіксовані на білках скефолду. Скефолд при цьому є жорсткою скелетною основою хромосоми і формує її вісь (рис. 6.12). В ранніх дослідженнях було з'ясовано, що мажорними компонентами скефолду є два білки, позначені як Sс I та Sс IІ. Пізніше виявилось, що перший з них – це ДНК-топоізомераза ІІα, а другий – SMC2. Тобто, скефолд складається, в основному, з топоізомерази ІІ та конденсинових комплексів, що добре узгоджується з аксіальним розміщенням цих білків у мітотичній хромосомі.

Згідно "осьових" моделей, хроматинова фібрила взаємодіє зі скефолдом у межах АТ-збагачених скефолд-асоційованих ділянок ДНК (SARs). Хроматинові петлі або просто радіально відходять від центральної білкової осі (у моделі радіальних петель), або (у моделі спірально закручених радіальних петель) скефолд разом з прикріпленими до нього петельними доменами спірально закручується, утворюючи більш складно організовану просторову структуру типу соленоїда (рис. 6.12). Оскільки петельні домени присутні також і в інтерфазному хроматині (підрозділ 4.3), згідно моделі радіальних петель компактизація хромосом супроводжується реорганізацією петельних доменів інтерфазного ядра з утворенням осьової білкової структури – скефолду, який є перебудованим ядерним матриксом і слугує структурною платформою для організації мітотичної хромосоми.

238

Фібрила 30 нм

Скефолд

Рис. 6.12. Схематичне зображення структури мітотичних хромосом згідно моделі радіальних петель, закріплених на скефолді (ліворуч) та її модифікації – моделі спірально закручених радіальних петель (праворуч). Репродуковано з роботи Ushiki et al. (2002) з дозволу

Модель радіальних петель, закріплених на скефолді, базується в основному на дослідженнях структури хромосом на фіксованих препаратах. А такий підхід не дає можливості дослідити процес компактизації хромосом у динаміці, він дозволяє лише бачити окремі часові "зрізи" структури. Сучасні методи візуалізації клітин без фіксації препаратів дали змогу досліджувати процеси компактизації/декомпактизації хромосом у реальному часі. Дані таких спостережень свідчать, що перехід від інтерфазного хроматину до мітотичної хромосоми і навпаки відбувається у декілька етапів з утворенням проміжних структур різного рівня компактизації. Ці результати привели до появи ієрархічних моделей ультраструктури мітотичної хромосоми

(hierarchical models).

239

В межах ієрархічного підходу існують два принципово різні погляди на організацію хромосом. Перший варіант передбачає, що під час ранньої профази фібрила 30 нм, спірально закручуючись, утворює соленоїд спочатку діаметром 100–150 нм, подальше ущільнення якого призводить до появи фібрил діаметром 200–300 нм і далі, під час середньої та пізньої профази, цей діаметр збільшується майже вдвічі і становить 500–750 нм, що відповідає діаметру мітотичної хромосоми (рис.

6.13).

Скефолд

Рис. 6.13. Схематичне зображення структури хромосоми згідно однієї з ієрархічних моделей. Репродуковано з роботи Kireeva et

al. (2004).

На відміну від моделі радіальних петель, закріплених на скефолді, така ієрархічна модель заперечує необхідність утворення осьового скелету хромосоми як основи, навкруг якої здійснюється компактизація хроматину. Скефолд згідно цих уявлень утворюється наприкінці конденсації в пізній профазі: на

240

користь цього свідчить аналіз розподілу SMC2 та топоізомерази ІІ у хроматині – осьова локалізація обох білків у хромосомі спостерігається лише в середній та пізній профазі (хоча, слід звернути увагу на те, що результати по розміщенню цих двох білків доволі суперечливі в різних експериментах). Таким чином, даний варіант ієрархічної моделі передбачає наявність додаткових факторів (інших білків?), що ініціюють компактизацію хромосом. Проте, кінцевий стан у цій моделі є схожим на такий у моделі радіальних петель у тому відношенні, що обидві моделі постулюють наявність скефолду, який стабілізує і підтримує структуру мітотичної хромосоми.

Ієрархічна модель другого типу є, знову, варіацією моделі радіальних петель. Вона базується на тих спостереженнях, що на перших стадіях компактизації формуються дискретні "глобули" діаметром ~100 нм – хромомери, які містять петлі хроматину. Модель передбачає, що хроматинова фібрила 30 нм спочатку утворює розеткові структури (хромомери), які складаються з петельних доменів, зібраних до купи. В процесі компактизації кількість петель у розетках та кількість самих розеток поступово зростає, а ядерний матрикс, до якого приєднані петлі, реорганізується у скефолд мітотичної хромосоми (рис. 6.14). Початок компактизації хромосом, зумовлений активністю топоізомерази ІІ, представляється в цій моделі як об'єднання окремих хроматинових петель у хромомери, закріплені на "первинному" скефолді. Ущільнення такої структури забезпечується конденсинами обох типів в процесі профази.