biohimiyа

биохимическая роль. Механизм действия окислительновосстановительных ферментов (оксидоредуктаз).

6.Коферменты, образующиеся из витаминов В3, В12, В6, Вс и их биохимическая роль. Механизм действия ферментов трансфераз.

Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________

Экспериментальная работа.

Опыт 1. Определение активности амилазы (диастазы) мочи по Вольгемуту.

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2.Набор пипеток.

3.Водяная баня.

Реактивы. 1. 0,85%-ный раствор хлорида натрия.

2.Моча.

3.Крахмал, 0,1%-ный раствор.

4.Реактив Люголя.

Принцип метода: Определение активности амилазы в биологических жидкостях (моча, сыворотка крови, слюна) основано на нахождении наименьшего количества фермента, необходимого для полного расщепления добавленного крахмала в стандартных условиях.

Амилазная активность мочи выражается количеством миллилитров 0,1% раствора крахмала, которое расщепляется ферментом, содержащимся в 1 мл неразведенной мочи, при температуре 450С за 15 минут.

В норме моча человека содержит мало амилазы, происходящей из поджелудочной железы. Активность амилазы (диастазы) мочи обозначается А450 (или d450). В норме активность амилазы мочи равна 16-64 ед.

Определение активности амилазы в моче и сыворотке крови широко используется в клинической практике с целью диагностики заболеваний поджелудочной железы. При острых панкреатитах амилазная активность мочи и сыворотки крови увеличивается в десятки раз, особенно в первые сутки заболевания, а затем постепенно возвращается к норме. При почечной недостаточности амилаза в моче отсутствует.

1.Пронумеруйте 10 пробирок. В каждую налейте по 1 мл 0,85% раствора хлорида натрия.

2.В первую пробирку налейте 1 мл исследуемой мочи, перемешайте, 3 раза втяните смесь в пипетку и выпустите ее в пробирку.

3.1 мл раствора перенесите во вторую пробирку, перемешайте, 3 раза втяните смесь в пипетку и выпустите ее в пробирку.

4.1 мл раствора перенесите в третью пробирку и т.д.

5.Из последней пробирки 1 мл смеси вылейте.

6.Во все пробирки добавьте по 1 мл 0,85% раствора хлорида натрия.

7.Начиная с десятой пробирки, добавьте во все пробирки по 2 мл 0,1%- ного раствора крахмала, перемешивая при этом содержимое всех пробирок.

8.Все 10 пробирок одновременно поставьте на 15 минут в водяную баню (450С, не допускать превышения температуры!).

31

9. Через 15 минут охладите пробирки под краном и в каждую добавьте по 2 капли реактива Люголя (раствора йода).

10.Результаты эксперимента занесите в таблицу:

Номер	Степень	Окраска содержимого пробирки после добавления
пробирки	разведения мочи	реактива Люголя
1	1:2
2	1:4
3	1:8
4	1:16
5	1:32
6	1:64
7	1:128
8	1:256
9	1:512
10	1:1024

11.Для подсчета активности амилазы мочи учитывают ту пробирку, в которой уже нет синего оттенка (т.е. пробирка с желтой окраской).

Расчѐт: Предположим, что полное расщепление крахмала произошло в первых четырѐх пробирках. В четвѐртой пробирке разведение мочи 1:16. Следовательно: 1/16 мл мочи расщепила 2 мл 0,1% раствора крахмала, 1 мл неразведенной мочи расщепит Х мл 0,1% раствора крахмала.

Х 2 1 16 32 1

Следовательно, активность амилазы (диастазы) мочи равна 32 ед.

Опыт 2. Изучение активности каталазы крови иммобилизованной на активированном угле.

Данная работа является простейшим способом доказательства того, что ферменты после иммобилизации, при соответствующих условиях среды, не теряют свою каталитическую активность.

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2.Набор пипеток.

3.Центрифуга.

4.Ступки.

Реактивы. 1. Уголь активированный, таблетки. 2. Кровь.

32

OH

3.Физраствор.

4.Перекись водорода, 3%-ный раствор.

Реактивы, оборудования: таблетки активированного угля, свежевзятая кровь, физиологический раствор, 2%-й раствор перекиси водорода, ступки, центрифуга.

1.Возьмите 2 таблетки активированного угля и разотрите их в ступках.

2.В одну из ступок добавьте 3 капли крови и еще раз разотрите.

3.После 10 минутной адсорбции фермента эритроцитов крови на активированном угле перенесите содержимое обеих ступок в центрифужные пробирки.

4.В обе пробирки добавьте по 2 мл физиологического раствора, перемешайте и центрифугируйте в течение 5 минут при 1000 об/мин.

5.После этого выньте пробирки из центрифуги, слейте надосадочную жидкость.

6.В осадок добавьте примерно по 1 мл раствора перекиси водорода.

7.Объясните полученные результаты.

Практическое задание

Фосфатазы - ферменты, катализирующие гидролиз фосфорных эфиров. В частности, их субстратом является пара-нитрофенилфосфат (пНФФ):

NO2	NO2

Образующийся в результате реакции

+ HO

P

OH

паранитрофенол в щелочной среде имеет жел-

OH

O

O

P

OH

OH

тую окраску. По интенсивности окраски рас-

O

твора определяют количество образовавшего-

ся продукта реакции. Используя эти данные, рассчитывают скорость ферментативной реакции.

a) Используя табличные данные, постройте график зависимости скорости ферментативной реакции, катализируемой фосфатазой, от концентрации субстрата.

Концентрация	Скорость реакции,
субстрата,	ммоль/(дм3*мин)
ммоль/дм3
0,5	8
1,0	15
2,0	28
3,0	35
4,0	38
5,0	40

33

Определите КМ и Vmax.

б) На основании данных о скорости ферментативной реакции при различных значениях рН, представленных в таблице, постройте график зависимости скорости ферментативной реакции от рН.

рН	Скорость реакции,
	ммоль/(дм3*мин)
4,1	15
4,5	35
5,0	55
5,5	60
6,0	61
6,5	50
7,0	35
7,5	25
8,0	02

Определите рН-оптимум фосфатазы.

__________________________________________________________________

__________________________________________________________________

__________________________________________________________________

в) Постройте график зависимости скорости ферментативной реакции от температуры. Данные о скорости ферментативной реакции при различных значениях температуры представлены в таблице.

Температура, оС	Скорость реакции,
	ммоль/(дм3*мин)
10	5
20	11
37	25
50	95
60	91
70	7,0
80	2,6

Определите температурный оптимум фосфатазы.

__________________________________________________________________

__________________________________________________________________

г) Конкурентным ингибитором фосфатаз является фосфат. Постройте графики зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в отсутствие и в присутствии фосфата. Данные представлены в таблице.

34

Концентрация субстрата,											Скорость реакции в отсут-														Скорость реакции в при-
		ммоль/дм3											ствие ингибитора,												сутствии ингибитора,
													ммоль/(дм3*мин)													ммоль/(дм3*мин)
0,5											8													4
1,0											15													7,5
2,0											28													14
3,0											35													17,5
4,0											38													19
5,0											40													20

Определите КМ и Vmax ферментативной реакции в присутствии и в отсутствие конкурентного ингибитора. Сделайте вывод, каким образом фосфат влияет на эти показатели.

д) Фторид является неконкурентным ингибитором фосфатаз. Постройте графики зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в отсутствие и в присутствии фторида. Данные представлены в таблице.

Концентрация субстрата	Скорость реакции в отсут-	Скорость реакции в при-
ммоль/дм3	ствие ингибитора,	сутствии ингибитора,
	ммоль/(дм3*мин)	ммоль/(дм3*мин)
0,5	8	5
1,0	15	10
2,0	28	18
3,0	35	24
4,0	38	30
5,0	40	35
6,0	-	38
8,0	-	40

35

Определите КМ и Vmax ферментативной реакции в присутствии и в отсутствие конкурентного ингибитора. Сделайте вывод, каким образом фторид влияет на эти показатели.

Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________

Занятие № 8. «Роль витаминов в метаболизме»

Цель занятия: изучить химические свойства некоторых витаминов, лежащих в основе их биологического действия.

ВОПРОСЫ К КОНТРОЛЬНОЙ РАБОТЕ:

1.Витамины: классификация и номенклатура. Гипо- и гипервитаминозы. Авитаминозы. Причины недостаточности витаминов в организме.

2.Коферменты, образующиеся из витаминов В1, Н. Механизм действия ферментов карбоксилирования и декарбоксилирования.

3.Коферменты, образующиеся из витаминов В2, В5, липоевая кислота и их биохимическая роль. Механизм действия окислительновосстановительных ферментов (оксидоредуктаз).

4.Коферменты, образующиеся из витаминов В3, В12, В6, Вс и их биохимическая роль. Механизм действия ферментов трансфераз.

5.Биохимические функции жирорастворимых витаминов.

Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________

36

Экспериментальная работа.

Опыт 1. Качественная реакция на витамин А.

Приборы. 1. Штатив с пробирками. 2. Набор пипеток.

Реактивы. 1. Масляный раствор витамина А.

2.Концентрированная серная кислота.

1.В пробирку налейте 3 капли масляного раствора витамина А.

2.Добавьте 1 каплю концентрированной серной кислоты.

Объясните, почему в пробирке появляется сине-фиолетовое окрашивание? Какими клиническими признаками выражается недостаток витамина А в организме? Как это связано с его биохимическими функциями?

Опыт 2. Обнаружение каротиноидов в моркови.

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2.Набор пипеток.

3.Стеклянная палочка.

Реактивы. 1. Морковь измельченная.

2.Серная кислота концентрированная.

3.Ацетон.

4.Перманганат калия, 2% раствор.

1.Небольшой кусочек моркови измельчите на мелкой терке и поместите полученную массу в пробирку.

2.Добавьте 2-3 мл любого неполярного растворителя (ацетон, гексан) и содержимое перемешайте стеклянной палочкой.

3.Отметьте изменение окраски растворителя.

4.Полученный экстракт желтого цвета перелейте в две пробирки.

5.В первую добавьте 1 каплю 2%-ного раствора перманганата калия, во вторую 1 каплю концентрированной серной кислоты.

Объясните, почему экстракт моркови имеет желтую окраску? Чем вызвано постепенное обесцвечивание раствора перманганата калия? Получили

37

ли Вы сине-фиолетовое окрашивание экстракта с серной кислотой? Обоснуйте свой ответ.

Опыт 3. Окислительно-востановительные свойства рибофлавина.

Приборы. 1. Штатив с пробирками. 2. Набор пипеток.

Реактивы. 1. Рибофлавин, 0,025% раствор.

2.Соляная кислота концентрированная.

3.Цинк металлический.

1.К 0,5 мл 0,025%-ного раствора рибофлавина добавьте 3 капли концентрированной соляной кислоты и кусочек металлического цинка. Под влиянием выделяющегося водорода окраска раствора постепенно розовеет, затем обесцвечивается.

2.Бесцветный раствор перелейте в другую пробирку и наблюдайте через некоторое время вновь появление желтого окрашивания.

Объясните наблюдаемые явления. Как данные процессы связаны с биохимическими функциями витамина В2?

Опыт 4. Качественная реакция на пиридоксин.

Приборы. 1. Штатив с пробирками. 2. Набор пипеток.

Реактивы. 1. Пиридоксин, 0,5% раствор.

2.Хлорное железо, 1% раствор.

1.К 0,5 мл 0,5% раствора пиридоксина добавьте 5 капель 1% раствора хлорного железа и перемешайте. Развивается красная окраска.

2.В одну пробирку поместите 1 мл водной вытяжки из серого хлеба, во вторую – 1 мл водной вытяжки из белого хлеба.

38

3.В обе пробирки добавьте по 1-2 капли 5% раствора хлорного железа. Встряхните.

Запишите результаты эксперимента. В вытяжке какого хлеба содержится больше витамина В6? Какие биохимические функции выполняет витамин В6 в организме человека и животных?

Опыт 5. Определение устойчивости витамина С при нагревании в разных условиях.

Приборы. 1. Колбы, 100 мл. 2. Набор пипеток.

Реактивы. 1. Шиповник настойка (хвои настойка).

2.Уксусная кислота, 0,6 М раствор.

3.Крахмал, 1% раствор.

4.Йод, 0,01 моль раствор.

5.Соляная кислота, 1мраствор.

6.Меди сульфат, 10%-ный раствор.

7.Перекись водорода, 3%-ный раствор.

1.Возьмите 6 колбочек.

2.В первую колбу налейте 25 мл свежеприготовленного раствора аскорбиновой кислоты (50 мг/100 мл воды).

3.Во все остальные – по 25 мл настойки шиповника (или по 25 мл настойки хвои).

4.Потом долейте: в 4-ю колбочку 5 мл 1М НСl, в 5-ю - 10 капель 3%

Н2О2, в 6-ю - 0,5 мл 10% раствора CuSO4.

5.Колбочки № 2, 3, 4, 5, 6 кипятите на водяной бане в течение 2 минут.

6.После охлаждения во все колбочки долейте по 2 мл 0,6 М уксусной кислоты и 3 мл 1%-ного раствора крахмала.

7.Титруйте каждую пробу раствором йода (Сн = 0,01 моль) до стойкого, не исчезающего в течение 30 секунд синего цвета.

8.Полученные результаты запишите в таблицу:

	Без нагревания			Условия нагревания
	Аскорби-	Настойка	Без
	новая	шипов-		HCl	H2O2	CuSO4
			реагента
	кислота	ника

V (I2) пошедшего на титрование

с (витамина С)

39

Сделайте выводы, при каких условиях витамин С сохраняется в наибольшей степени. Из чего синтезируется в организме животных витамин С? Какова биологическая роль витамина С в организме?

Задание 1. Заполните таблицу, обобщающую сведения об основных коферментах.

	Название	Витамин-	Биохимическая роль кофермента в катализе
	кофермента	предшественник
1.	НАД+, НАДФ+
2.	ФМН, ФАД+
3.	ТПФ
4.	Биоцитин
5.	КоА
6.	ПФ
7.	ТГФК

Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________

Занятие № 9. «Гормональная регуляция обмена веществ»

Цель занятия: сформировать знания о роли гормонов в регуляции метаболизма и биологических процессов в организме. Освоить качественную реакцию определения адреналина, инсулина.

ВОПРОСЫ К КОНТРОЛЬНОЙ РАБОТЕ:

1.Гормоны. Строение и классификация.

2.Механизм действия липофильных гормонов.

40