biohimiyа

Занятие № 18. Коллоквиум II: «Обмен веществ и энергии»

Цель занятия: осуществить рубежный контроль знаний.

ВОПРОСЫ К КОЛЛОКВИУМУ:

1.Охарактеризуйте обмен веществ и энергии – как сопряженную систему катаболических и анаболических процессов.

2.Макроэргические вещества и радикалы. Строение и функции АТФ в организме.

3.Промежуточные метаболиты-доноры электронов и протонов для клеточного дыхания.

4.Дыхательная цепь и комплексы с переносом заряда.

5.Структура и функции различных компонентов дыхательной цепи.

6.Функции АТФ-синтазы и молекулярного кислорода в клеточном дыхании.

7.Механизм синтеза АТФ путем окислительного фосфорилирования.

8.Механизм и биологическое значение разобщения окислительного фосфорилирования.

9.Цикл лимонной кислоты – центральный процесс энергетического обмена.

10.Регулирование скорости цикла лимонной кислоты.

11.Пути образования активного ацетила.

12.Пути потребления активного ацетила.

13.Назначение и пути потребления кетоновых тел.

14.Пути образования и превращения ПВК.

15.Пути образования и превращения ЩУК.

16.Синтез жира из углеводов.

17.Особенности превращений углеводов в пищеварительном тракте и в ходе метаболизма в организме жвачных.

18.Синтез и распад гликогена в печени. Гликогенолиз в мышцах. Регуляция этих процессов.

19.Биохимические механизмы поддержания нормального уровня глюкозы в крови при голодании.

20.Биологическое значение пентозного пути окисления углеводов.

21.Возможные пути превращения глюкозо-6-фосфата в печени.

22.Нарушения углеводного обмена.

23.Пути образования и превращений фосфатидной кислоты.

24.Спонтанное свободнорадикальное окисление ненасыщенных соединений

ипути его предотвращения. Антиоксиданты.

25.Строение и функции клеточных мембран, их участие в метаболизме.

26.Транспорт липидов в организме.

27.Метаболизм липидов и холестерина.

28.Строение, синтез и биологическое значение холестерола.

29.Биологически активные производные холестерина.

30.Нарушения липидного обмена.

Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________

71

Занятие № 19. «Белковый обмен (часть 1)»

Цель занятия: изучить методы количественного определения белков; освоить расчетные методы определения биологической ценности белков.

ВОПРОСЫ К КОНТРОЛЬНОЙ РАБОТЕ:

1.Аминокислоты: строение и классификация.

2.Белки: строение и классификация.

3.Биохимическая роль аминокислот и белков.

4.Физико-химические свойства аминокислот и белков.

5.Переваривание белков. Протеазы пищеварительного тракта, механизм их активации. Всасывание белков и аминокислот.

Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________

Экспериментальная работа.

Опыт 1. Количественное определение общего белка в сыворотке крови.

В плазме крови содержится до 200 различных белковых компонентов. Большая часть выполняемой функции крови, так или иначе, связана с белками плазмы: поддержание онкотического давления, участие в процессах свертывания крови, регуляции рН крови, выполнение транспортной и защитной функции, функции «белкового резерва» и др. Качественное и количественное постоянство белкового состава крови четко поддерживается организмом, и любые изменения в этой системе, как правило, являются отражением нарушенного функционирования тех или органов и тканей.

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2.Набор пипеток.

3.Центрифуга.

4.Центрифужные пробирки.

5.Водяная баня.

6.ФЭК.

7.Кюветы, 10 мм.

Реактивы. 1. Сыворотка крови.

2.Трихлоруксусная кислота, 3%-ный раствор в этаноле.

3.Биуретовый реактив.

4.Хлорид натрия, 0,85%-ный раствор.

Определение концентрации общего белка.

1.0,1 мл сыворотки крови внесите в пробирку, содержащую 2,4 мл 0,85% раствора хлористого натрия.

2.Прибавьте 2,5 мл биуретового реактива.

3.Термостатируйте 30 мин при 37оС, измерьте оптическую плотность при зеленом светофильтре (540-560 нм) в кювете с толщиной слоя 10 мм.

4.Концентрацию общего белка определите по калибровочному графику.

72

Калибровочный график для определения концентрации белка биуретовым методом.

0

0

0

Сравните полученные значения с нормальными величинами. О чем свидетельствует снижение (повышение) уровня белка в сыворотке крови у животных?

Опыт 2. Белки как противоядие от ионов тяжелых металлов.

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2.Набор пипеток.

3.Водяная баня.

Реактивы. 1. Амилаза, раствор.

2.Крахмал, 1%-ный раствор.

3.Ацетат свинца, 1%-ный раствор.

4.Молоко.

5.Дистиллированная вода.

6.Йод, 1%-ный раствор.

1.Возьмите две пробирки.

2.В опытную пробирку налейте по 1 мл раствора амилазы, 1%-ного раствора крахмала, 1%-ного раствора ацетата свинца (II) и молока.

3.В контрольную пробирку налейте по 1 мл растворов амилазы, крахмала, ацетата свинца (II) и воды.

4.Пробирки встряхните и выдержите 10 минут при температуре 37°С.

5.Добавьте в обе пробирки по 1 капле 1%-ного раствора йода.

Объясните полученные результаты.

73

Расчетные методы определения биологической ценности белка.

Продукция животноводства в целом, в первую очередь, представляет ценность как источник белка в рационе человека. Основным фактором, определяющим биологическую ценность белков пищи, является их аминограмма, т.е. количественное соотношение содержащихся в белке аминокислот, в первую очередь восьми незаменимых для человека – лизина, лейцина, изолей-

цина, метионина, триптофана, фенилаланина, валина и треонина.

Один из способов определения биологической ценности (БЦ) белков пищи основан на коэффициенте различия аминокислотного скора (КРАС,

%). Он показывает среднюю величину избытка аминокислотного скора незаменимых аминокислот по сравнению с наименьшим уровнем скора какойлибо незаменимой аминокислоты. Аминокислотный скор определяют по формуле:

а АКпродукт 100

АКэталон

где АКпродукт – содержание незаменимой аминокислоты в 1 г исследуемого белка, мг; АКэталон – содержание той же аминокислоты в 1 г «идеального» (эталонного) белка, мг; 100 – коэффициент пересчета в проценты.

На базе данных, полученных рядом исследователей в ходе обменных опытов, международной организацией ФАО/ВОЗ (ФАО - продовольственная и сельскохозяйственная организация ООН; ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения) был предложен следующий

		ЭТАЛОН
	содержания незаменимых аминокислот в пищевом белке:
	Аминокислота		Содержание в г
			на 100 г белка
	Изолейцин		4,0
	Лейцин		7,0
	Лизин		5,5
	Серосодержащие аминокислоты (метионин + цистеин)		3,5
	Ароматические аминокислоты	(фенилаланин + тирозин)	6,0
	Треонин		4,0
	Триптофан		1,0
	Валин		5,0

74

Содержание незаменимых (для человека) аминокислот в некоторых видах продуктов, г на 100 г белка

				Аминокислоты
Продукты	Вал	Иле	Лей	Лиз	Мет	Цис	Тре		Три	Фен	Тир
Говядина I категории	10,35	7,82	14,78	15,89	4,45	2,59		8,03	2,1	7,95	6,58
Свинина мясная	8,31	7,08	10,74	12,39	3,42	1,83		6,54	1,91	5,8	5,2
Баранина I категории	8,2	7,54	11,16	12,35	3,56	2,05		6,88	1,98	6,11	5,24
Конина I категории	9,96	7,99	14,94	17,39	4,73	3,01		9,23	2,82	8,57	6,87
Курятина	4,9	5,3	7,2	8,8	2,6	1,6		4,3	1,2	3,9	3,5
Мясо кроликов	10,64	8,67	17,34	21,99	4,99	2,59		9,13	3,27	5,12	4,64
Мясо ягнят	8,25	8,52	13,66	16,09	4,0	2,03		7,78	2,53	7,03	6,04
Мясо поросят	9,1	9,8	9,9	22,3	4,4	-		7,83	4,0	18,1	17,1
Телятина I категории	11,56	9,98	14,84	16,83	4,14	2,36		8,55	2,45	7,91	6,89
Мозги говяжьи	6,02	5,46	9,7	8,41	2,32	2,45		5,4	1,64	5,69	3,75
Печень говяжья	12,47	9,26	15,94	14,33	4,38	3,18		8,12	2,38	9,28	7,31
Почки говяжьи	8,57	7,14	12,4	11,54	3,26	2,89		6,38	2,14	6,77	4,34
Сердце говяжье	9,11	8,38	14,08	13,59	3,83	2,68		7,4	2,22	6,76	4,96
Рубец говяжий	3,8	3,4	6,0	5,0	1,6	-		3,3	1,0	3,4	-
Колбаса вареная	6,72	5,47	9,13	9,45	3,51	1,87		5,29	1,51	5,08	3,73
докторская
Сосиски молочные	6,3	5,67	7,57	8,39	1,11	1,58		3,57	2,03	3,69	3,19
Колбаса сырокопченая	13,33	10,95	18,3	20,2	7,43	2,86		10,2	3,67	9,53	8,7
сервелат
Яйцо куриное целое	6,0	4,7	8,5	7,1	3,3	-		4,8	1,6	5,1	-
Желатин пищевой	2,0	1,3	2,7	4,3	0,1	-		1,4	0,1	1,7	-
Рис	6,5	4,5	8,2	3,7	2,5	2,1		4,0	1,3	4,8	6,5
Фасоль	4,8	5,8	5,2	1,5	1,0	3,8		1,4	1,4	2,4	2,1
Кукуруза	4,2	3,6	11,5	2,7	1,8	1,4		3,4	0.5	4,3	3,6
Пшеничная мука	4,6	3,9	6,9	3,0	1,6	1,9		3,5	1,3	4,8	2,1
Гречиха	5,2	4,0	6,0	6,1	1,6	1,2		3,5	1,0	3,3	2,0
Просо	4,5	3,1	7,3	2,9	1,3	3,2		2,5	1,6	3,5	1,4

Лимитирующей биологическую ценность аминокислотой считается та, скор которой наименьший.

КРАС

PАC n

где ∆РАС – избыток скора аминокислоты; n – количество незаменимых аминокислот.

∆РАС = Сi - Сmin

где Сi – избыток скора аминокислоты;

Сmin - минимальный из скоров незаменимых аминокислот исследуемого белка по отношению к эталону, %.

75

Биологическую ценность (БЦ) пищевого белка (%) определяют по формуле:

БЦ = 100 – КРАС Рассчитайте биологическую ценность нескольких видов продуктов питания:

Незаменимая

Эталон

Белок

Белок

Белок

…………………..

…………………..

…………………..

аминокислота

ФАО/ВОЗ

АК

С

∆РАС

АК

С

∆РАС

АК

С

∆РАС

1

Изолейцин

4,0

2

Лейцин

7,0

3

Лизин

5,5

4

Фенилаланин+тирозин

6,0

5

Метионин+цистеин

3,5

6

Треонин

4,0

7

Триптофан

1,0

8

Валин

5,0

Σ∆РАС

КРАС

БЦ

Примечание:

* - первая лимитирующая аминокислота; АК – содержание аминокислоты в 100 г белка; С – аминокислотный скор, %; ∆РАС – различие аминокислотного скора%; БЦ – биологическая ценность, %

Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________

Занятие № 20. «Белковый обмен (часть 2)»

Цель занятия: изучить метаболизм аминокислот.

ВОПРОСЫ К КОНТРОЛЬНОЙ РАБОТЕ:

1.Механизм реакций трансаминирования. Биологическая роль данного процесса.

2.Пути декарбоксилирования аминокислот. Биологическое значение конечных продуктов этих реакций

3.Дезаминирование аминокислот. Биологическое значение конечных продуктов этих реакций.

4.Роль ароматических аминокислот в метаболизме.

5.Роль серосодержащих аминокислот в метаболизме.

76

Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________

Экспериментальная работа.

Опыт 1. Расщепление белка под действием щелочи.

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2.Набор пипеток.

3.Газовая горелка.

4.Держатель для пробирок.

Реактивы. 1. Яичный белок, 30%-ный раствор.

2.Желатин, 30%-ный раствор.

3.Гидроксид натрия или калия, 30%-ный раствор.

4.Ацетат свинца, 10%-ный раствор.

1.В пробирку налейте 1 мл 30%-ного раствора яичного белка.

2.Добавьте двойной объем концентрированного раствора щелочи и кипятите смесь в течение 2-3 мин. При этом выпадает осадок (иногда незначительный), растворяющийся при дальнейшем кипячении, и выделяется аммиак.

3.К полученному горячему сильнощелочному раствору добавьте 1 мл раствора ацетата свинца и снова кипятите смесь; образующийся сначала белый осадок гидроксида свинца растворяется в избытке щелочи. Если белок при действии щелочи отщепляет серу, то образуется сульфид свинца, в результате чего прозрачная жидкость постепенно окрашивается в коричневый цвет; при относительно высоком содержании отщепляемой серы выпадает темно-коричневый или черный осадок сульфида свинца.

4.Повторите пункт 1-3 с раствором желатина.

Объясните полученные результаты и наблюдавшиеся эффекты.

Опыт 2. Количественное определение активности аланинаминотрансферазы (АлАТ) в сыворотке крови.

Аминотрансферазы или трансаминазы катализируют межмолекулярный перенос аминогруппы с аминокислот на кетокислоты. АлАТ катализирует реакцию переаминирования между аланином и -кетоглутаровой кислотой. По количеству образовавшейся пи-

77

ровиноградной кислоты можно судить об активности фермента. Количество пировиноградной кислоты определяется колориметрическим путем по цветной реакции с 2,4- динитрофенилгидразином, при которой развивается красно-бурое окрашивание.

1. В две пробирки внесите реактивы согласно следующей таблице:

	Контрольная проба	Опытная проба
Реагент 1 (АлАТ, субстрат), мл	0,25	0,25
Дистиллированная вода, мл	0,05	–
Сыворотка, мл	–	0,05
Перемешать и инкубировать 30 мин
Реагент 2	0,25	0,25
(динитрофенилгидразин), мл
Перемешать и оставить при комнатной температуре на 20 мин
NaOH (С = 0,4 моль/л), мл	2,5	2,5

2.Перемешайте и через 10 минут измерьте оптическую плотность пробы против контрольной пробы при длине волны 540 нм, кювета с толщиной слоя 5 мм.

3.Активность АлАТ в опытной пробе определите по калибровочному графику в нмоль/с л.

	Калибровочный график для определения активности АлАТ
	0,12
плотность	0,1
	0,08
Оптическая	0,06
	0,04
	0,02
	0
	0	50	100	150	200	250	300	350	400	450	500	550	600
					Активность АлАТ, нмоль/с л

Сравните полученный результат с физиологическими величинами и сделайте вывод. Опишите механизм работы кофермента трансаминаз.

78

Опыт 3. Качественная реакция на наличие фенилпировиноградной кислоты в моче.

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2.Набор пипеток.

3.Стеклянная воронка.

4.Фильтр.

Реактивы. 1. Моча.

2.Серная кислота, 5 н раствор.

3.Хлорид железа (III), 10%-ный раствор.

1.В пробирку налейте 5 мл свежепрофильтрованной мочи.

2.Долейте 4 капли 5 н раствора серной кислоты. Перемешайте и добавьте к смеси 4 капли 10%-ного раствора хлорида железа (III).

При наличии в моче фенилпировиноградной кислоты через 30 секунд-1 минуту появляется сине-зеленая окраска, исчезающая через 5-10 минут.

Запишите полученные результаты. В каких случаях возможно появление фенилпировиноградной кислоты в моче? Чем опасно накопление данного метаболита в тканях организма животных?

Опыт 4. Определение концентрации белка в моче.

Появление в моче белка носит название альбуминурия. Различают истинную альбуминурию, при которой почки пропускают мочу, уже содержащую белок, и случайную, когда почки выделяют нормальную мочу, но затем в нее попадают белоксодержащие примеси (кровь, гной, семя). Альбуминурия наблюдается при нефритах, расстройстве сердечной деятельности, острых инфекционных заболеваниях, иногда беременности.

Принцип метода: Метод основан на образовании тонкого кольца осадка белка при наслоении мочи на реактив Ларионовой или 50% азотную кислоту. Экспериментально установлено, что растворы, содержащие 0,033 г/л, дают мутное белое колечко между второй и третьей минутой после наслаивания.

Приборы. 1. Штатив с пробирками. 2. Набор пипеток.

Реактивы. 1. Реактив Ларионовой.

2.Моча.

3.Дистиллированная вода.

79

а) Качественное определение белка.

1.В пробирку налейте 1 мл реактива Ларионовой.

2.Затем осторожно, по стенке наслоите такое же количество мочи.

3.При наличии белка в моче появляется мутное белое колечко между 2 и 3 минутой после наслаивания.

б) Количественное определение белка.

1.В 5 пробирок внесите по 2 мл дистиллированной воды. В первую прилейте 2 мл мочи, перемешайте и перенесите 2 мл полученной смеси во вторую пробирку и т.д. Из пятой пробирки возьмите 2 мл смеси и отбросьте. Таким образом получают пробы мочи с разведением в 2, 4, 8, 16 и 32 раза.

2.В другие 5 пробирок налейте по 1 мл реактива Ларионовой. Затем осторожно, по стенке наслоите такое же количество мочи. Отметьте, в какой пробирке между 2-ой и 3-ей минутами появилось белковое кольцо.

3.Чтобы вычислить содержание белка в исследуемой моче, необходимо 0,033 г/л умножить на степень разведения в этой пробирке.

Запишите Ваши результаты.

Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________

Занятие № 21. «Биохимическая детоксикация»

Цель занятия: изучить пути обезвреживания токсичных соединений.

ВОПРОСЫ К КОНТРОЛЬНОЙ РАБОТЕ:

1.Пути образования и обезвреживания аммиака. Чем отличаются уреотелические, урикотелические и аммониетелические животные? Чем объяснить возникновение разных путей выведения аммиака из организма птиц, млекопитающих и рыб?

2.Цикл образования мочевины. Пути образования орнитина и аспарагиновой кислоты для обеспечения орнитинового цикла.

80