biohimiyа

3.Механизм действия гидрофильных гормонов.

4.Гормоны поджелудочной железы и их биологическая роль.

5.Гормоны щитовидной железы и их биологическая роль.

6.Гормоны надпочечников и их биологическая роль.

7.Половые гормоны и их биологическая роль.

Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________

Экспериментальная работа.

Опыт 1. Влияние физической нагрузки на содержание глюкозы в крови.

Концентрация глюкозы в крови контролируется центральной нервной системой и железами внутренней секреции. Поэтому в здоровом организме возможны лишь кратковременные колебания уровня глюкозы в крови.

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2.Набор пипеток.

3.Скарификатор стерильный.

Реактивы. 1. Тест-набор для определения глюкозы.

1.У испытуемого (добровольца) возьмите из пальца 0,1 мл крови.

2.Определите количество глюкозы в крови при помощи тест-полосок.

3.Затем он выполняет физические упражнения (например, 50-60 приседаний), и через 15-20 минут у него снова возьмите 0,1 мл крови из пальца для анализа.

Сравните полученные результаты и объясните их.

Опыт 2. Качественная реакция на адреналин.

Метод основан на способности пирокатехиновой группировки адреналина образовывать с FeCl3 комплексное соединение изумрудно-зеленого цвета.

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2.Набор пипеток.

3.Стеклянная воронка.

4.Фильтр.

5.Ступка с пестиком.

6.Водяная баня.

Реактивы. 1. Поджелудочная железа, или 0,1%-ный раствор адреналина.

2.Хлорид железа (III), 1%-ный раствор.

3.Аммиак, концентрированный раствор.

Подготовка проб.

Надпочечники КРС или свиней измельчают и экстрагируют адреналин дистиллированной водой, подкисленной лимонной или щавелевой кислотой из расчета на 1 кг надпочечников

41

1,5 литра дистиллированной воды и 9-10 г кислоты. После двух часов экстракции массу подогревают до 90-95оС для коагуляции белков, которые отделяют фильтрованием или центрифугированием. Фильтрат или надосадочную жидкость используют для качественного определения адреналина.

1.В пробирку налейте 10 капель 0,1%-ного раствора адреналина и до-

бавьте 1 каплю 1%-ного раствора FeCl3. Наблюдайте за появлением характерного окрашивания.

2.Добавьте 1 каплю концентрированного раствора аммиака. Наблюдайте за изменением окрашивания.

Объясните полученные результаты. Какие биохимические процессы в организме запускает адреналин?

Опыт 3. Качественные реакции инсулина поджелудочной железы.

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2.Набор пипеток.

3.Стеклянная воронка.

4.Фильтр.

5.Ступка с пестиком.

6.Водяная баня.

Реактивы. 1. Поджелудочная железа.

2.Ацетон подкисленный.

3.Сульфат меди, 2%-ный раствор.

4.Гидроксид натрия, 10%-ный раствор.

5.Азотная кислота, концентрированная.

6.Ацетат свинца, 0,5%-ный раствор.

1.Свежую или замороженную поджелудочную железу КРС или свиней тщательно измельчите, и экстрагируйте подкисленным этанолом (ацетоном) (в соотношении 1:10) на холоде 10 минут.

2.Полученный экстракт профильтруйте.

3.С фильтратом проведите биуретовую реакцию, ксантопротеиновую реакцию, реакцию Фоля.

Биуретовая реакция.

В пробирку поместите 0,5 мл фильтрата. Добавьте 0,5 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия, а затем 2-3 капли 2%-ного раствора сульфата меди (II). Красно-фиолетовое окрашивание свидетельствует о положительной реакции.

42

Ксантопротеиновая реакция.

В пробирку поместите 0,5 мл фильтрата. Добавьте 3 капли концентрированной азотной кислоты и нагрейте на кипящей водяной бане. Желтое окрашивание свидетельствует о положительной реакции.

Реакция Фоля.

В пробирку налейте 0,5 мл фильтрата. Добавьте равный 0,5 мл гидроксида натрия, нагрейте до кипения и прибавьте 1-2 капли 0,5%-ного раствора ацетата свинца. Потемнение раствора свидетельствует о положительной реакции.

На основании полученных результатов сделайте вывод о строении инсулина. На какие биохимические процессы и как влияет инсулин?

Задание 1. Заполните таблицу, обобщающую сведения о влиянии гормонов на обмен углеводов.

		Место	Хими-
			ческая			Влияние на
		синте-			Влияние на процессы об-
	Название		приро-	Ткани-		концентра-
		за			мена
	гормона		да	мишени		цию глюкозы
		гор-			углеводов
			гормо-			в крови
		мона
			на
	Инсулин
	Адрена-
	лин
	Глюкагон
	Кортизол

Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________

43

Занятие № 10. Коллоквиум I: «Уровни организации биогенных соединений. Ферменты. Витамины. Гормоны»

Цель занятия: осуществить рубежный контроль знаний.

ВОПРОСЫ К КОЛЛОКВИУМУ:

1.Охарактеризуйте наиболее важные биологические функции воды. Как эти функции связаны со строением молекулы воды?

2.Что такое рН растворов? Раскройте значение этого показателя для живых организмов.

3.Механизм действия буферных растворов.

4.Элементы-органогены. Влияние органогенов на свойства биогенных соединений.

5.Основные виды атомных группировок в составе биогенных соединений.

6.Биохимические функции минеральных субстратов. Макро-, и микроэлементы.

7.Биологические функции и классификация аминокислот.

8.Биологические функции и классификация пептидов.

9.Биологические функции и классификация белков.

10.Уровни организации белковых молекул. Механизм денатурации и ренатурации.

11.Изоэлектрическая точка и изоэлектрическое состояние аминокислот и белков. Физико-химические свойства аминокислот и белков.

12.Денатурация и факторы ее вызывающие.

13.Общие и отличительные свойства неорганического катализатора и фермента.

14.Чем обусловлена специфичность ферментов? Виды специфичности.

15.Методы определения и способы выражения активности ферментов.

16.Клиническое значение определения активности ферментов в биологических жидкостях.

17.Строение ферментов. Ферменты простые и сложные. Биологическое значение апофермента и кофермента.

18.Механизм ферментного катализа.

19.Биологические функции активного и аллостерического центров фермента.

20.Активаторы и ингибиторы ферментов, их биологическая роль. 21.Способы регулирования активности ферментов. 22.Мультиферментные комплексы, проферменты, изоферменты и их био-

химическое значение.

23.Классификация и номенклатура ферментов.

24.Витамины – как предшественники коферментов.

25.Витамины группы В и их биохимические функции.

26.Строение и биохимические функции витамина А.

44

27.Строение и биохимические функции витамина Д.

28.Строение и биохимические функции витамина Е.

29.Строение и биохимические функции витамина К.

30.Роль гормонов в регуляции метаболизма. Классификация гормонов по химическому строению и биологическим функциям.

31.Строение, механизм синтеза и биологическая роль эйкозаноидов. 32.Биохимическая роль вторичных мессенджеров при передаче гормо-

нального сигнала.

33.Механизм действия и передачи сигнала гормонов стероидной природы. 34.Механизм действия и передачи сигнала гормонов аминокислотной и

белковой природы.

35.Сравните действие на клетки гормонов липофильных и гидрофильных.

Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________

Занятие № 11. «Обмен веществ и энергии»

Цель занятия: сформировать знания об основах биоэнергетики клетки, представление о макроэргах тканей (АТФ, креатинфосфат). Систематизировать знания об общих путях катаболизма в организме как основных источниках энергии для синтеза АТФ. Сформировать представление о роли кислорода в окислительных процессах.

ВОПРОСЫ К КОНТРОЛЬНОЙ РАБОТЕ:

1.Общая характеристика обмена веществ и энергии. Катаболизм и анаболизм. Сопряжение экзергонических и эндергонических реакций.

2.Высокоэнергетические биомолекулы и радикалы. Главные структурные особенности высокоэнергетических фосфатов: пирофосфат, ATФ, фосфоэфиры. Почему именно ATФ выбрана природой в качестве формы сохранения химической энергии в клетке?

3.Пути синтеза и расходования АТФ в организме животных.

4.Цепь переноса электронов (ЦПЭ). Строение: местоположение цепи; строение переносчиков электронов; расположение переносчиков электронов в цепи; факторы, влияющие на определенную направленность движения электронов по дыхательной цепи; назовите подвижные звенья дыхательной цепи.

5.Механизм синтеза АТФ АТФ-синтазой. Баланс между синтезом АТФ и транспортом электронов. От чего зависит коэффициент фосфорилирования (Р/О)?

6.Разобщение окислительного фосфорилирования. Факторы, вызывающие разобщение окисления с фосфорилированием. Биологическое значение этого процесса.

Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________

45

Экспериментальная работа.

Опыт 1. Сопоставление окислительно-восстановительных потенциалов рибофлавина.

Приборы. 1. Штатив с пробирками. 2. Набор пипеток.

Реактивы. 1. Дистиллированная вода.

2.Рибофлавин, 0,025%-ный раствор.

3.Метиленовая синь, 0,01%-ный раствор.

4.Соляная кислота, концентрированная.

Для исследования окислительно-восстановительных потенциалов применяют индикаторы, имеющие свой цвет при определенном значении этого потенциала.

1.В пробирку с 1 мл воды добавьте 3 капли рибофлавина (0,025% раствор) и по каплям 0,01% раствор метиленового синего до появления синего или сине-зеленого окрашивания.

2.Внесите в пробирку кусочек цинка и 2-3 капли концентрированной НСl. Отметьте постепенное изменение окраски.

3.Бледно-желтую жидкость слейте в другую пробирку. Оцените цвет жидкости в пробирке через 10-15 минут.

Объясните наблюдаемые явления.

Опыт 2. Открытие активности альдегиддегидрогеназы в молоке.

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2.Набор пипеток.

3.Водяная баня.

4.Пробки.

Реактивы. 1. Молоко, кипяченое и некипяченое.

2.Формалин, 0,4%-ный раствор.

3.Метиленовая синь, 0,01%-ный раствор.

1.Налейте в пробирки по 3 мл молока из пронумерованных колбочек соответственно (в одной из них молоко кипяченое, в другой нет).

46

2.В обе пробирки внесите 6 капель 0,4%-ного раствора формальдегида и несколько капель 0,01%-ного раствора метиленовой сини (до появления голубого окрашивания).

3.Пробирки встряхните и быстро закройте пробками для того, чтобы создать относительно анаэробные условия.

4.Поместите пробирки в водяную баню (37оС) и отметьте постепенное обесцвечивание метиленовой сини через 5-10 минут (в зависимости от активности фермента) в одной из пробирок.

5.После обесцвечивания содержимое пробирки несколько раз встряхните и наблюдайте за изменением цвета.

Определите, в какой пробирке содержалось некипяченое молоко? Объясните, почему Вы сделали такой вывод? Почему после встряхивания обесцвеченной пробирки произошло изменение цвета?

Опыт 3. Качественное определение креатинина.

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2.Набор пипеток.

3.Газовая горелка.

4.Держатели для пробирок.

Реактивы. 1. Мышечная ткань.

2.Пикриновая кислота, насыщенный раствор.

3.Гидроксид натрия, 10%-ный раствор.

1.К 1-2 мл фильтрата мышечной ткани, свободного от белков1, добавьте

1Приготовление мышечного экстракта.

1.На технических весах взвесьте 10 г мышечной ткани мяса.

2.Отмерьте 50 мл охлажденного 0,04 М раствора никотинамида и залейте им взятую навеску. Затем мышцы из-

мельчите ножницами, добавьте кварцевый песок, разотрите в ступке до получения гомогенной массы и экстрагируйте 30-40 мин.

3.После этого полученный экстракт перенесите в центрифужные пробирки и центрифугируйте при 3000 об/мин в течение 10 мин.

Получение безбелкового фильтрата.

1.3 мл мышечного экстракта (см. выше) внесите в центрифужную пробирку и добавьте осторожно (!) такое же количество 5%-ного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). При наличии белка раствор мутнеет.

2.Центрифугируйте при 3000 об/мин в течение 5 мин. Белок при этом осаждается.

3.Надосадочную жидкость (безбелковый фильтрат, он должен быть прозрачным!) используйте в опыте.

47

3 капли насыщенного раствора пикриновой кислоты (ядовита!).

2.Проведите подщелачивание раствора добавлением нескольких капель 10%-ного гидроксида натрия. Через несколько минут появляется оран- жево-красная окраска. Температура ускоряет реакцию.

3.Проделайте опыт с фильтратами красных и белых мышечных волокон.

4.Сделайте вывод о содержании креатинина в разных мышцах и причинах, обуславливающих это различие.

Задание 1. Заполните таблицу:

	Ком-		Участвует ли в
	плекс		переносе:		Кофермент	Акцептор	Донор
	дыха-	Название комплекса	элек-	про-
					(название)	электронов	электронов
	тельной		тронов	тонов
	цепи
	I
	II
	III
	IV
	V

Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________

Занятие № 12. «Цикл трикарбоновых кислот»

Цель занятия: изучить механизм некоторых реакций цикла Кребса. Освоить метод количественного определения пировиноградной кислоты в моче.

ВОПРОСЫ К КОНТРОЛЬНОЙ РАБОТЕ:

48

1.Окислительное декарбоксилирование пирувата как предварительный этап цикла лимонной кислоты. Перечислите витамины и коферменты, задействованные в этом процессе.

2.Реакции цикла лимонной кислоты. Что определяет общее направление реакций в цикле? В какой части клетки протекает этот процесс? Почему?

3.Какие коферменты и витамины участвуют в цикле Кребса? Объясните, как они работают, с указанием конкретных реакций.

4.Расскажите о реакциях цикла Кребса, в результате которых образуются НAДH2 и ФAДН2. Какова дальнейшая судьба этих соединений?

5.Функции цикла трикарбоновых кислот. Объясните, какое значение для цикла лимонной кислоты имеет анаплеротическая реакция?

6.Энергетический выход цикла трикарбоновых кислот. Сколько молекул ATФ образуется в ходе оборота через цикл одной молекулы лимонной кислоты? Все ли молекулы ATФ, образующиеся при полном окислении активного ацетила, синтезируются путем окислительного фосфорилирования. Как регулируется скорость цикла?

Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________

Экспериментальная работа.

Одним из методов количественного анализа в биохимии является фотокалориметрия. Метод основан на измерении оптической плотности окрашенных растворов, которые получают при взаимодействии субстрата с различными химическими агентами. Концентрация субстрата пропорциональна степени окрашивания раствора.

Перед началом лабораторных опытов ознакомьтесь с устройством КФК и правилами работы на нем.

Опыт 1. Определение концентрации пировиноградной кислоты (ПВК) в моче.

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2.Набор пипеток.

3.Фотоколориметр.

4.Кюветы, 0,5 см.

Реактивы. 1. Дистиллированная вода.

2.Моча.

3.Гидроксид натрия, 10%-ный раствор.

4.2,4-динитрофенилгидразин, раствор.

ПВК крови конденсируется с 2,4-динитрофинилгидразином с образованием гидразона, который в щелочной среде дает коричнево-красный цвет раствора. По интенсивности его окраски судят о содержании ПВК.

1. В три пробирки внесите реактивы согласно следующей таблице:

49

	Раствор	Опытная	Калибровочная	Контрольная
		проба, мл	проба, мл	проба, мл
	Исследуемый образец	2	-	-
	Калибр. раствор пирувата*	-	2	-
	Дистиллированная вода	-	-	2
	2,4-динитрофенилгидразин	0,8	0,8	0,8

2.Содержимое пробирок на 15 мин поместите в темное место при комнатной температуре.

3.В каждую пробирку внесите по 1 мл 10%-го раствора NаOH и через пять минут измерьте оптическую плотность при длине волны 620 нм опытной пробы против контрольной (О) и калибровочной пробы против контрольной (К).

4.Расчет проведите по следующей формуле:

Концентрация ПВК =	О	2ммоль
			л
	К

5. Расчет проведите и по готовому калибровочному графику.

Калибровочный график зависимости величины оптической плотности раствора (D) от концентрации ПВК в пробе.

Расчет содержания ПВК в суточной моче (на диурез 1500 мл):

мкгПВК 1500

1000	= мг/сутки

Для пересчета содержания ПВК (в мг) в единицы количества вещества (мкмоль) надо умножить соответствующие величины на 11,4 (коэффициент пересчета).

Норма для человека: 10-25 мг/сутки или 114-284 мкмоль/сутки пировиноградной кислоты.

50