Идентификация вируса
Идентификацию вируса до уровня семейства проводят с помощью следующих тестов:
1. Определение типа нуклеиновой кислоты вириона. Интерпретацию результатов проводится по цветной пробе, то есть по наличию или отсутствию роста в чувствительных тест-системах. Размножение ДНК-содержащих вирусов ингибируется бромдезоксиуридином, в то время как РНК-содержащие вирусы нечувствительны к этому реактиву.
2. Определение наличия суперкапсидной оболочки..Вирусы, имеющие суперкапсидную оболочку, содержат липиды и поэтому чувствительны к обработке эфиром. При последующем испытании биологической активности они теряют свою инфекционность.
3.Определение размеров вириона. Размер вириона определяют по способности вируса проходить через поры мембранных фильтров известного диаметра. До и после фильтрации проверяют инфекционность исследуемого материала методом цветной пробы.
4.Определение наличия или отсутствия гемагглютинина. Некоторые вирусы обладают гемагглютинирующей активностью. Ее учитывают в реакции гемагглютинации.
5.Идентификацию вируса до вида, внутривидовую идентификацию чаще всего проводят в реакции вируснейтрализации с соответствующими сыворотками.
6.Учет результатов реакции проводится в зависимости от биологии вируса:по результатам РТГА; по цветной пробе; по отсутствию цитопатического действия; по выживаемости чувствительных животных;
- по отсутствию изменений при заражении куриных эмбрионов.
МИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
Микроскопическое исследование
Микроскопия – это один из основных методов в лабораторной диагностике микозов. Проводить это исследование необходимо с того дня, когда на питательной среде появляются первые колонии. Перед микроскопическим исследованием необходимо знать является гриб дрожжевым или плесневым – по внешнему виду колоний, результатам проростковой пробы.
При микроскопии плесневых грибов учитывают структуру мицеллия (т.е. особенности строения гиф, их цвет, септированность; особенности строения конидиев и спор, включая размер, форму, цвет конидиев; строение их клеточной стенки, септированность и т.д.)
Для проведения микроскопии готовят нативные и окрашенные препараты.
Для приготовления окрашенных препаратов материал обрабатывают различными способами:
1. Окраска PAS-методом для эумицетов. Использование РAS-метода позволяет выявить нейтральные полисахариды в стенках микроорганизмов. Нейтральные полисахариды – это глюкан-маннановый комплекс, находящийся в клеточной стенке большинства эумицетов, за счет него и происходит окрашивание.
PAS-реакции – один из методов микроскопической диагностики тканевых форм грибковой инфекции. В практических лабораториях для микроскопической диагностики используются различные модификации этого метода: окисление хромовой кислоты – реакция Бауэра; окраска по Гридли.
2. Окраска по методу Грама (модификация по Грам-Вайгерту) для выявления сопутствующих микроорганизмов.
3. Окраска по Циль-Нильсону для выявления кислотоустойчивых микроорганизмов. Если исследуемый материал жидкий, то из него готовят неокрашенный мазок для микроскопии в просветляющих жидкостях: смесь спирта с глицерином в соотношении 1:1.
Следующий этап это микологическое исследование – выделение и идентификация грибов. Рассмотрим особенности этого этапа в зависимости от исследуемого материала.
Микологическое исследование
Культуральное исследование. Культуральное исследование основано на выделение возбудителя из исследуемого материала. Сроки культивирования различны для разных видов грибов (от 2-4 дней до 4 недель), при подозрении на диморфные грибы культуру выделяют до 8 недель. Основными средами для культивирования в микологической лаборатории является среда Сабуро: декстрозный агар Сабуро (плотная среда), бульон Сабуро (жидкая среда). Для подавления роста бактериальной флоры в среду Сабуро добавляют антибиотики (хлорамфеникол, гентамицин, реже стрептомицин, пенициллин). Для подавления роста сапрофитных грибов в среду добавляют циклогексимид, хлорамфеникол. Существуют готовые среды с циклогексимидом (Mycobiotic Mycosel).
Оптимальным режимом культивирования для большинства патогенных грибов является 300С, 20-250С, реже 370С – при подозрении на диморфные грибы. Длительность инкубации для большинства грибов составляет не более 4 недель; если по прошествию этого времени роста не наблюдается, то дают отрицательный ответ. В случае подозрения на диморфный микоз при отсутствии роста в течение 4 недель, культуру выдерживают 8 недель и только после этого дают отрицательный результат.
При культуральном исследовании диагностически значимым являются:
- выделение любого плесневого гриба, если этот гриб был обнаружен микроскопически;
- выделение плесневого или дрожжевого гриба, при исследовании стерильного в норме материала;
- выделение диморфного гриба;
- выделение грибов рода Cryptococcus;
- выделение дерматофитов из кожи, волос, ногтей.
Алгоритм микологического исследования
1. Определение грибковой этиологии возбудителя (микроскопия).
2. Определяют дрожжевой гриб или плесневый:
- микроскопия клинического материала (наличия мицеллия);
- посев на питательную среду. Для выделения и идентификации грибов используют плотные и жидкие среды Сабуро, сусло-агар. Эти среды обеспечивают рост большинства патогенных и условно-патогенных грибов. Для подавления роста сопутствующей бактериальной флоры в среды добавляют такие антибиотики как хлорамфеникол, стрептомицин. Пенициллин. При выделении грибов дерматофитов для подавления роста плесневых грибов, грибов рода Candida,Сryptococcus neoformans в среду Сабуро добавляют циклогексимид. При выделении прихотливых грибов, посевы делают на среды, обогащенные кровью и сердечно-мозговым экстрактом:среда Чапека (для формирования конидий при идентификации плесневых грибов); картофельный и рисовый агары - для выявления получения хламидиоспор при идентификации грибов рода Candida; морковный агар – для получения типичных колоний культуры гриба Trichophyton schonleini; среду Кашкина – для выделения пигментообразующих грибов; ДДС для Сandida albicans – для определения фосфолипазной активности грибов;
- инкубируют грибы от несколько суток (для дрожжевых грибов) до 1 месяца для мицелиальных грибов
- характер колоний на питательной среде, скорость роста (дрожжевые грибы растут 48 часов, плесневые грибы растут медленно).При подозрении на патогенные диморфные грибы для выдачи отрицательного ответа культивирование проводят в течение 8 недель.
3. Окончательную идентификацию гриба до уровня вида (внутривидовая) проводят на основании комплекса культуральных, морфологических, биохимических признаков. При исследовании биохимических свойств изучают способность выделенной культуры к ассимиляции (ауксанограмма) и ферментации (зигограмма). Возможно использование автоматизированных систем идентификации (тест-системы для идентификации грибов).
ПАРАЗИТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
Макро и микроскопические паразитологические методы лабораторной диагностики являются прямыми методами обнаружения гельминтов, их фрагментов, яиц и личинок гельминтов; вегетативных и цистных форм простейших. Используемые в диагностике микроскопические методы применяются по показаниям.
Материал, предназначенный для исследования, помещают в чисто вымытую посуду, которую закрывают крышкой или пробкой, упаковывают в деревянный ящик или бюкс и транспортируют в лабораторию.
Фекалии.
1.Макроскопическое исследование. Исследование начинают сосмотра всей порции кала для обнаружения невооруженным глазом или с помощью лупы целых гельминтов или их фрагментов. Фекалии разводят водой до жидкой консистенции и небольшими порциями рассматривают в стеклянном кристаллизаторе или чашке Петри при хорошем освещении на темном фоне.
Чтобы лучше просмотреть кал, применяют метод отстаивания. В высоких стеклянных банках смешивают кал с большим количеством воды и отстаивают. Жидкость сливают, а осадок снова разводят водой. Так проделывают несколько раз, пока жидкость не станет прозрачной. Осадок исследуют с помощью лупы.
Все образования, подозрительные на фрагменты гельминтов, рассматривают между двумя предметными стеклами, под лупой в капле глицерина, а при необходимости под микроскопом.
Дифференциация отдельных видов гельминтов основана на их анатомо-морфологических особенностях.
Определение вида нематод возможно по целям особям, реже - по крупным фрагментам, сохранившим характерные органы. Цестоды идентифицируют по зрелым членикам, гермафродитным членикам и сколексам.
Макроскопическое исследование позволяет обнаружить острицы, членики или обрывки стробилы.