2. Основные хроматографические величины и их определение

При разделении веществ с помощью ЖХ могут применяться проявительный, фронтальный и вытеснительный варианты. Чаще всего используют проявительный вариант, при котором в колонку в потоке элюента вводят порцию разделяемой смеси. Выход компонентов смеси из колонки регистрируется на хроматограмме в виде пиков (рис. 1 а). Высота или площадь пиков характеризует концентрацию компонентов, а удерживаемые объемы – качественный состав смеси. Идентификацию компонентов обычно проводят по совпадению времен удерживания со стандартными веществами; используют также физико-химические химические или химические методы.

При фронтальном варианте через колонку непрерывно пропускают смесь разделяемых веществ, которая играет роль подвижной фазы. Хроматограмма в этом случае представляет собой ступени, высоты которых пропорциональны концентрациям компонентов; удерживаемые объемы определяют по времени удерживания компонентов (рис. 1 б). При дифференцировании такой хроматограммы получают картину, как в проявительном варианте.

Рисунок 1 – Варианты жидкостной хроматографии:

а – проявительный; б – фронтальный; в – вытеснительный.

В вытеснительном варианте (рис. 1 в) компоненты смеси, введенной в колонку, вытесняются элюентом, который адсорбируется сильнее любого компонента. Порядок выхода компонентов определяется силой взаимодействия их с поверхностью сорбента.

3. Адсорбенты

Основной адсорбент – кремнезем (силикагель), гидроксилированный или химически модифицированный; используют также Аl₂О₃, углеродные адсорбенты, полимеры, содержащие ионогенные, комплексообразующие группы или группы, способные к специфическим взаимодействиям с биологически активными веществами. Размер частиц силикагеля в аналитических колонках 3–10 мкм, в препаративных – 20–70 мкм. Малый размер частиц увеличивает скорость массообмена и повышает эффективность колонки. Современные аналитические колонки длиной 10–25 см, заполненные силикагелем с размером частиц5 мкм, позволяют разделить сложные смеси из 20–30 компонентов. При уменьшении размера частиц до 3–5 мкм возрастает эффективность колонки, но и растет ее сопротивление и для достижения скорости потока элюента 0,5–2,0 см³мин^-1 требуется давление (1–3)10⁴ кПа. Силикагель выдерживает такой перепад давления, гранулы же полимерных сорбентов более эластичны и деформируются. В последнее время разработаны механически прочные густо-сетчатые полимерные сорбенты макропористой структуры, приближающиеся по своей эффективности к силикагелям. Форма частиц сорбента размером 10 мкм и выше не оказывает большого влияния на эффективность колонки, однако предпочитают сферические сорбенты, которые дают более проницаемую упаковку. Внутренняя структура частицы силикагеля представляет собой систему сообщающихся каналов. Для ЖХ используют сорбенты с диаметром пор 6–25 нм и удельной поверхностью 600–100 м²г^-1. Разделение в ЖХ проводят в основном на силикагелях, модифицированных реакцией алкил- и арилхлорсиланов или алкилэтоксисиланов с силанольными группами поверхности. С помощью таких реакций прививают группы С₈Н₁₇, С₁₈Н₃₇ или С₆Н₅ (для получения сорбентов с гидрофобизированной поверхностью), -аминопропильные, нитрильные, гидроксильные (в диольных сорбентах) группы и другие. Сорбенты с гидрофобизированной поверхностью углеродной природы получают также пиролизом органических соединений на поверхности силикагеля. В ион-парной, лигандообменной и адсорбционной хроматографиях используют метод динамического адсорбционного модифицирования, при котором в элюент вводят незначительные добавки адсорбирующегося на поверхности адсорбента соединения, содержащего функциональную группу, которая обеспечивает желаемый механизм разделения. Например, при разделении углеводов на гидроксилированном силикагеле в элюент добавляют пиперазин. Возможна также постоянная адсорбционная модификация поверхности желаемым реагентом при использовании элюента, не смывающего последний.