4. Элюенты

Элюенты должны обладать низкой вязкостью, обеспечивать необходимый уровень селективности, быть дешевыми, нетоксичными, инертными, совместимыми с методами детектирования. В нормально-фазной хроматографии обычно используют углеводороды (гексан, гептан, изооктан, циклогексан) с добавлением небольших количеств хлороформа, изоропилового спирта, диизопропилового эфира; в обращенно-фазной – смесь воды с ацетонитрилом, метанолом, этанолом, диоксаном, тетрагидрофураном, диметилформамидом. Если компоненты разделяемой смеси имеют сильно отличаюшиеся времена удерживания – их хроматографируют одним элюентом (изократический режим), если отдельные компоненты смеси сильно удерживаются сорбентом – используют серию элюентов возрастающей силы (ступенчатое или непрерывное градиентное элюирование).

5. Применение жх

ЖХ – важнейший физико-химический метод исследования в химии, биологии, биохимии, медицине, биотехнологии. Ее используют для анализа, разделения, очистки и выделения аминокислот, пептидов, белков, ферментов, вирусов, нуклеотидов, нуклеиновых кислот, углеводов, липидов, гормонов и т. д. Она применяется при изучении процессов метаболизма в живых организмах лекарственных препаратов, диагностике в медицине, анализе продуктов химического и нефтехимического синтеза, полупродуктов, красителей, топлив, смазок, нефтей, сточных вод. В физико-химии ее используют для изучения изотерм сорбции из раствора, кинетики и селективности химических процессов. В химии высокомолекулярных соединений и в производстве полимеров с помощью ЖХ анализируют качество мономеров, изучают молекулярно-массовое распределение и распределение по типам функциональности олигомеров и полимеров, что необходимо для контроля продукции. ЖХ используют также в парфюмерии, пищевой промышленности, для анализа загрязнений окружающей среды, в криминалистике.

2. Тонкослойная хроматография

Важным методом, позволяющим разделить и идентифицировать вещества в микроколичествах, является хроматография в тонком слое, или тонкослойная хроматография (ТСХ), относящаяся к плоскостной (планарной) хроматографии (в отличие от колоночной хроматографии). Этот метод был открыт в СССР Н. А. Измайловым и Г. С. Шрайбер в 1938 г. на примере разделения смеси растительных экстрактов непосредственно на покровных стеклах микроскопов, на которые предварительно наносили тонкий слой неорганического сорбента. В 1944 г. Р. Кондсен разработал метод хроматографии на бумаге, который вскоре получил чрезвычайно широкое распространение, в особенности в биохимических исследованиях и в анализе красителей. В этом методе в качестве сорбента используют специально приготовленные сорта фильтровальной бумаги. В отличие от ТСХ бумажная хроматография относится не к адсорбционной, а к распределительной хроматографии, так как в ней используется различие в распределении гидрофильных веществ между подвижной водной фазой и водой, удерживаемой целлюлозным носителем. В современной же ТСХ применяются специальные методы и специальная, хоть и достаточно простая, аппаратура.

1. Основы метода. Качественный и количественный анализ в тсх

В ТСХ используют стеклянные, металлические или пластмассовые пластинки, покрытые тонким слоем сорбента, обычно толщиной 0,1–0,3 млм. Образцы, как правило, 2–10 мкг, наносят в виде 0,1–1 %-ных растворов на слой вблизи основания пластинки (стартовая линия). Пластинку помещают в камеру (кювету), содержащую небольшое количество соответствующей жидкой подвижной фазы (элюента), которая перемещается по слою под действием капиллярных сил. При этом компоненты образца перемещаются через слой с различными скоростями, зависящими от адсорбционных коэффициентов компонентов смеси. Проявление заканчивают, удаляя пластинку из камеры и испаряя подвижную фазу.

Количественной мерой скорости переноса вещества при использовании определенного сорбента и элюента является величина R_f (oт английского retention factor) – фактор задержки. Величину R_f рассчитывают как частное от деления расстояния от центра пятна до линии старта (а) на величину пробега растворителя от стартовой линии (в) (рис. 2):

В соответствии с определением R_f всех адсорбированных компонентов смеси всегда меньше 1.00. Иногда вместо R_f используют величину hR_f , причем

hR_f = 100R_f

Величина R_f, зависит от природы сорбента и элюента. Для идентификации конкретных соединений смеси удобно использовать т.н. «свидетель», в качестве которого берут один из предполагаемых компонентов исследуемой смеси. Тогда совпадение R_f «свидетеля» и одного из компонентов может говорить об их идентичности. Однако для большей достоверности этого заключения необходимо провести эксперименты, взяв различные сорбенты и элюенты.

Количественный анализ методом ТСХ выполняется посредством хроматографирования стандартных растворов исследуемых компонентов вместе с исследуемым образцом. Количество вещества в пятне связывают с площадью и интенсивностью выявленного пятна; стандарты и образцы можно сравнить визуально, но это недостаточно точный и объективный способ. Лучшие результаты дают методы спектроскопии, денситометрии и т.п.

Материал пятна можно вымыть из неподвижной фазы и использовать для дальнейшего исследования. Его можно количественно измерить спектрофотометрически. Неизвестные вещества идентифицируют методом ИК спектроскопии, масс-спектроскопии или подвергают дальнейшему разделению с помощью газовой хроматографии (см. раздел 3). Для этих целей величины образцов могут быть увеличины путем использования слоев большой толщины (до 2 мм), нанесением образца в виде полосы и применением более широких пластинок.

а – расстояние от стартовой до фронтальной линии; b – расстояние от стартовой линии до центра пятна исследуемого соединения; c – расстояние от стартовой линии до центра пятна «свидетеля».

Рисунок 2 – Расчет коэффициента задержки (R_f) соединения и идентификации соединения