Определение активности амилолитических ферментов
Принцип метода. Основан на извлечении амилаз из растений раствором хлористого натрия, действии их на крахмал и определении колориметрическим путем негидролизованного крахмала.
Ход работы. Навеску муки 0,1–1 г (листьев или проростков – 5г) растирают с песком в фарфоровой ступке с 1%– ным раствором NaCl и переносят в стакан. Соотношение между навеской растительного материала и NaCl должно быть 1:10. Стакан с раствором ставят в холодильник на 1–1,5 ч, при этом содержимое периодически помешивают палочкой для выделения белков. Затем содержимое стакана переносят в центрифужные пробирки и встряхивают в течение 30 мин. После этого центрифугируют при 4–5 тыс. об/мин 10 мин. Полученную прозрачную жидкость используют в качестве ферментного препарата для определения активности амилаз.
Определение суммарной активности амилаз. В 2 сухие пробирки вносят по 3 мл 0,2 н. ацетатного буфера рН 5,5 и по 3 мл 2 %–ного раствора крахмала. Смесь нагревают до 40 С, приливают точно 0,2–0,4 мл ферментного препарата и перемешивают. В контрольную пробирку наливают 0,2–0,4 мл воды. Пробирки ставят в термостат при 40 С на 30 мин. За это время под действием амилаз крахмал гидролизуется. Закончив инкубацию, в каждую пробирку вносят по 2 мл 1 н. раствора НСl для прекращения действия фермента. Затем из каждой пробирки берут по 0,5 мл смеси и вносят в мерные колбы на 50 мл, в которые предварительно прилито 30–40 мл воды,1 мл 0,1н. НСl и 5 капель 0,3 %–ного раствора йода 3 %–ном растворе йодистого калия. Колбы доводят до метки водой, тщательно перемешивают и затем колориметрируют на спектрофотометре при 595 нм (на фотоэлектроколориметре при красном светофильтре).
Вычисление результатов проводят по формуле:
,
(10)
где Е – активность амилазы в миллиграммах гидролизованного крахмала за 1 час 1 мл ферментного раствора
Dк – оптическая плотность контрольного раствора;
Dо – оптическая плотность опытного раствора;
С – количество внесенного крахмала (3 мл 2 % – ного раствора крахмала = 60 мг), мг.
Так как время инкубации составляло 30 мин, полученный результат умножают на 2, а количество взятого для анализа ферментного раствора приводят к 1 мл; необходимо учесть все разбавления). Для вычисления удельной активности определяют содержание белка в ферментном растворе (в миллиграммах) и полученную активность Е выражают в миллиграммах гидролизованного крахмала на 1мг белка за 1 ч (или за 1 мин).
Определение активности –амилазы. В оставшуюся часть фильтрата (5–8 мл) добавляют на кончике шпателя сухого уксуснокислого кальция и ставят на водяную баню при 70 С, выдерживают 15 мин, затем быстро охлаждают. –Амилаза при таких условиях инактивируется практически полностью. Далее этот раствор используют для определения –амилазной активности по методике, описанной выше.
Вычисление результатов активности –амилазы проводят так же, как и суммарной активности амилаз.
Активность –амилазы определяют по разности между суммарной активностью амилаз и активностью –амилазы.
Материалы и реактивы. 1 %–ный раствор NaCl; 0,2 н. ацетатный буфер рН 5,5; 2 %–растворимый крахмал (свежеприготовленный); 1 н НСl; 0,1 н НСl; 0,3 %–ный раствор йода в 3 %–ном растворе йодистого калия (см. Приложение 1, п. 2); уксуснокислый кальций (сухой).
Оборудование. Спектрофотометр или фотоэлектроколориметр, термостат, водяная баня, холодильник, центрифуга, стаканы, колбы мерные на 50 мл, градуированные пипетки, пробирки.