Практикум_по_акушерству_и_гинекологии

ношение (приблизительно). Например, если движется около 60% спермиев, прямолинейно-поступательное – это 6 баллов. Иногда движущиеся в одном направлении спермии образуют поток или струю, порождающую завихрения, что легко спутать с манежным движением, однако вихревые движения быстро исчезают. Для отработки навыков полезно вначале определить процент прямоли- нейно-поступательных спермиев, потом процент неподвижных, процент с манежным, процент с колебательным, затем результаты сложить и сумма должна быть 100%. Свои навыки полезно проверить, используя объективный способ определения активности.

Объективный способ – основан на точном подсчёте активных и неактивных спермиев с получением достоверного результата. При смешивании спермы с водным раствором эозина живые спермии с прямолинейно-поступательным движением (активные) не окрашиваются, а мертвые, ослабленные (с манежным и колебательным движением) имеют повышенную проницаемость для красителя и вследствие этого окрашиваются.

Техника приготовления препарата. На край предметного стекла (обезжиренного) пипеткой или стеклянной палочкой наносят небольшую каплю спермы и 2-3 капли 5%-го водного раствора эозина. Капли быстро перемешивают и из смеси делают тонкий мазок спермы. Мазок быстро высыхает на воздухе (1 мин считается нормой, если больше – мазок толстый).

Определение активности. Под микроскопом при увеличении в 400-600 раз в нескольких полях зрения подсчитывают подряд 500 неокрашенных (живых, активных) спермиев и окрашенных (мертвых, ослабленных) отдельно учитывая количество неокрашенных.

Полученный процент живых спермиев выражает активность спермиев в баллах.

Для окончательного подсчета используют формулу

Ж 100 , %, 500

где П – процент живых спермиев; Ж – число живых (неокрашенных) спермиев.

Однако данный способ оценки активности спермы довольно трудоёмкий, продолжительный и не получил широкого распространения в производстве.

Для разбавления и хранения допускают густую сперму быка,

49

барана, густую или среднюю по густоте сперму хряка и жеребца. Редкая сперма непригодна для искусственного осеменения и бракуется. Необходимо также запомнить минимально допустимые нормы активности спермиев (показатели нормокинеспермии):

а) для разбавления и хранения:

свежее семя быка не ниже – 8 баллов;

свежее семя барана не ниже – 8 баллов;

свежее семя хряка не ниже – 7 баллов;

свежее семя жеребца не ниже – 5 баллов;

свежее семя петуха не ниже – 7 баллов;

б) для искусственного осеменения после хранения при температуре тающего льда (2-5оС):

семя быка активность не ниже – 7 баллов;

семя барана активность не ниже – 8 баллов;

семя жеребца активность не ниже – 5 баллов;

семя хряка активность не ниже – 6 баллов;

в) для искусственного осеменения после хранения при температуре -196оС в жидком азоте:

жеребца – 2 балла;

быка – 4 балла, если бык проверен по качеству потомства – 3 балла;

барана – 4 балла.

Вслучае отклонения показателей активности спермы следует указывать степень её нарушения. Олигокинеспермия – пониженная активность спермы, акинеспермия – отсутствие подвижности спермиев, некроспермия – содержание преимущественно мертвых спермиев.

Контрольные вопросы

1.При какой температуре следует проводить микроскопирование спермы?

2.Какую оценку имеет сперма в зависимости от насыщенности спермиями?

3.Что означает обозначение Г-7, С-6, Р-6?

4.Какие растворы нужно использовать при оценке спермы на актив-

ность?

5.Для чего используется столик Морозова при оценке спермы?

6.Какие виды движения спермиев вы знаете?

7.Что такое манежное движение?

50

8.При каком увеличении нужно м икроскопировать сперму?

9.Понятие об олигоспермии.

10.Какие существуют методики для определения активности сперм и-

ев?

11.Почему визуальная оценка активности спермы с помощью микр о- скопирования считается субъективной?

12.Как правильно приготовить препарат спермы в зависимости от вида животных?

13.Норма активности свежего семени у производителей сельскохо-

зяйственных животных.

14.Допустимая активность криоконсервированной спермы после ра з- мораживания.

15.Продолжительность оттаивания замороженной спермодозы.

16.Какая должна быть температура в водяной бане?

17.Почему спермии, имеющие прямолинейно -поступательное движе-

ние, не окрашиваются эозином?

Занятие 6. Определение концентрации спермиев с помощью счетной камеры Горяева

Цель занятия: изучить методику подсчета концентрации спермиев с помощью камеры Горяева.

Материал и оборудование: счетные камеры Горяева, эритроцитарные и лейкоцитарные смесители (меланжеры), покровные стекла, 3% раствор натрия хлорида, свежеполученная или размороженная сперма, спиртовые тампоны, резиновая груша, пробирки, часовое стекло, водяная баня, длинный анатомический пинцет, ножницы, ватные тампоны, марлевые салфетки, стеклянные градуированные пипетки.

Задание 1: определить концентрацию спермы.

Концентрация спермиев – это степень насыщенности спермы половыми клетками, которая выражается количеством спермиев в 1 мл спермы.

Определение густоты спермы путем глазомерной оценки не дает полного представления о количестве спермиев в эякуляте, кроме того, при определении густоты возможны большие ошибки. Знание концентрации спермиев необходимо, чтобы точно рассчитать, во сколько раз можно разбавить свежеполученную сперму и сколько самок можно осеменить одним эякулятом.

51

Концентрация спермиев, как и другие показатели, зависит от условий кормления, содержания, режима использования производителя, а также от индивидуальных особенностей (табл. 2).

Определение концентрации спермиев с помощью счетной камеры производят в следующей последовательности:

а) подготовка счетной камеры; б) разбавление спермы в смесителе или пробирке;

в) зарядка счетной камеры разбавленной спермой; г) подсчет количества спермиев в счетной камере;

д) вычисление концентрации спермиев в исследуемой сперме.

				Таблица 2
Концентрация спермиев у производителей разных видов
Производитель	Концентрация, млрд. в 1 мл
	минимально допустимая	средняя		максимальная
Баран	2,0	2,5-3,5		8,0
Бык	0,6	0,8-1,2		6,0
Жеребец	0,05	0,1-0,15		0,8
Хряк	0,1	0,15-0,2		1,0

Устройство и подготовка счетной камеры. Глубина камеры

0,1 мм, в одной сетке 25 больших квадратов по 5 в ряду, каждый разделен добавочными линиями на 16 малых квадратиков. Общая площадь сетки равна 9 мм2.

Все детали камеры перед сборкой следует обработать спиртовым тампоном и протереть марлевой салфеткой. Покровное стекло необходимо приложить к камере, прижать края стекла к боковым бровкам до появления радужных колец Ньютона. После фиксации стекла камера готова к заправке разбавленной спермой.

Разбавление спермы в смесителе. Разбавление спермы произ-

водят в специальном смесителе (меланжере) – стеклянной пипетке с пузырьковидным расширителем или пробирке с использованием 3% раствора натрия хлорида, обеспечивающего гибель половых клеток, следовательно, их неподвижность и возможность проведе-

ния подсчета. При разбавлении компоненты следует						набирать
в определённом соотношении (табл. 3).
						Таблица 3
	Степень разбавления спермы
Сперма	Смеситель	Отметки, до которых набирают:				Степень
		сперму		3% р-р NаСl		разбавления
Барана	эритроцитный	0,5		101		200

52

Быка	эритроцитный	1,0	101	100
Хряка, жеребца	лейкоцитный	0,5	11	20

Зарядка счетной камеры разбавленной спермой производится сразу же после перемешивания, если это сделать позже, то спермии начнут оседать, что приводит к грубым ошибкам при определении концентрации.

Первые четыре капли, не содержащие спермиев, из пипетки смесителя удаляют.

Методика подсчета. Спермии подсчитывают в 80 малых квадратиках, расположенных в 5 больших по диагонали. Порядок подсчета спермиев отражён на рисунке 7.

А

Б

Рис. 7. Сетка камеры Горяева:

А – сетка при малом увеличении; Б – сетка большого квадратика и траектория подсчёта спермиев (закрашенные клетки, учитываемые в первом квадратике)

Подсчет ведется по принципу буквы Г, так как другие стороны квадрата подсчитываются при возвращении. В малом квадратике подсчитываются все спермии, головки которых расположены

впросвете квадратика и на его верхней и левой боковой гранях.

Всоседнем квадратике используется тот же принцип, что исключает возможность повторного учёта одних и тех же спермиев и

гарантирует точность исследования.

Для получения более точных результатов в камере Горяева рекомендуют считать спермиев в двух сетках и при вычислении концентрации брать среднее из 2-х подсчетов (разница будет не больше 10%, если считать в трех сетках и брать два более подходящих результата).

53

Концентрацию спермиев определяют по формуле

	С =	N Д 400	, млрд./мл,
		n p 1000000

где С – концентрация спермиев;

N – число подсчитанных спермиев; Д – степень разбавления;

n – число малых квадратиков (80);

р – глубина счетной камеры (0,1 мм); 400 – множитель для пересчета на 1 мм2 (поскольку площадь

одного малого квадратика равна 1 мм2);

400

1000000 – число для перевода миллионов в 1 мм3 или в миллиарды в 1 мл (см3).

Существуют упрощенные формулы:

для быков – С = N ;

200

для баранов – С = N ;

100

для хряков, жеребцов – С = 1000N .

После окончания работы счетные камеры и стекла промывают вначале простой, а потом дистиллированной водой, и насухо вытирают марлевой салфеткой. Из смесителя удаляют остатки спермы и сразу же промывают их дистиллированной водой, затем спирт-эфиром. Высушивают смесители продуванием воздуха при помощи резиновой груши.

Определение концентрации спермиев в счетных камерах требует много времени. Поэтому на племпредприятиях используют специальные приборы.

Результаты исследований могут указывать на наличие патологических процессов, существенно влияющих на концентрацию спермиев в сперме. Так, если концентрация спермы окажется меньше физиологической нормы, то говорят об олигоспермии, если при подсчете не удалось обнаружить спермиев – аспермия.

54

Контрольные вопросы

1.Понятие о концентрации спермы.

2.Концентрация спермы у производителей разных видов.

3.Порядок определения концентрации с помощью камеры Горяева.

4.Степень разбавления спермы для подсчета у производителей разных видов.

5.Какой меланжер используют при определении концентрации спе р- мы быка?

6.Как готовят камеру Горяева?

7.Правила подсчета спермиев в камере Горяева.

8.Почему используют для разбавления спермы 3% раствор NаСl?

9.Формула определения концентрации у разных видов производите-

лей.

10. Почему разница при подсчетах не должна превышать 10%?

Занятие 7. Определение концентрации спермиев с помощью концентрационного фотоэлектроколориметра

(КФК) и оптических стандартов

Цель занятия: изучить методику работы с концентрационным фотоэлектроколориметром (КФК). Овладеть методикой построения калибровочной кривой и определения концентрации спермиев.

Материал и оборудование: прибор КФК, три кюветы с расстоянием между рабочими гранями 5 мм, чистые сухие пенициллиновые флаконы, пипетки градуированные на 0,1 мл или 0,2 мл, пипетка на 5 мл, 3,5% раствор цитрата натрия, сосуд на 0,5 л с дистиллированной водой, счетная камера Горяева, смесители (меланжеры) эритроцитарные и лейкоцитарные, покровные стекла, 96% этиловый спирт, эфир, 3% раствор натрия хлорида, резиновая груша, марлевые салфетки, спиртовые тампоны, свежеполученная сперма.

Задание 1:

1)ознакомиться с работой КФК и методикой определения концентрации спермиев;

2)построить калибровочную прямую.

Фотоэлектроколориметр – это прибор, работающий на основе фотоэлементов, которые преобразуют световой поток, проходящий через кювету с образцом разбавленной спермы, в электри-

55

ческую энергию (фотоэлементы цезиевые и селеновые).

Прибор необходимо включать за 20 мин до начала исследования для выделения полного светового спектра. Следует также открыть кюветное отделение, установить ручку светофильтра на красный фильтр.

Концентрационный фотоэлектроколориметр (КФК) – прибор, измеряющий интенсивность окраски или точнее – степень оптической плотность растворов.

Сущность методики определения концентрации спермиев с использованием этого прибора состоит в том, что пучок света определенной волны, пропущенный через кювету с разбавленной спермой, попадая на селеновые фотоэлементы, преобразуется в электрическую энергию, отклоняющую стрелку гальванометра, на котором отражены деления шкалы оптической плотности и коэффициента светопропускания. Отклонение стрелки напрямую зависит от величины электрического тока, проходящего через гальванометр, которая обратно пропорциональна мутности спермы.

При помощи этого прибора достаточно точно и быстро (1-2 мин) можно подсчитать концентрацию спермиев в сперме, тогда как с использованием счетной камеры Горяева для подсчета требуется 10-25 мин.

Предварительная настройка прибора заключается в установке стрелки прибора на ноль при прохождении пучка света через кювету с разбавителем, что делает данный раствор для прибора оптически прозрачным и малейшее присутствие спермиев в пробе будет менять оптическую плотность.

Для определения концентрации спермиев с помощью КФК необходимо, прежде всего, построить калибровочную (градуировочную) кривую, изображающую зависимость оптической плотности от концентрации спермиев. Для построения калибровочной кривой из свежевзятых эякулятов выбирают несколько таких, в которых концентрация спермиев высокая.

Из отобранных эякулятов путем разбавления их 3,0% раство-

ром лимоннокислого натрия 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:60, 1:80, 1:100, 1:120, 1: 140, 1:160, 1:180, 1:200, 1:220, 1:240, 1:260 (всего 15-20

разведений) готовят ряд образцов спермы и уточняют концентрацию спермиев в каждом из них по методике счетной камеры Горяева.

Затем определяют величину оптической плотности каждого

56

образца с помощью КФК. Зная фактическую концентрацию спермиев, установленную в счетной камере, строим калибровочную кривую. Для этого на миллиметровой бумаге откладывают: по горизонтальной оси – известные концентрации, по вертикальной – соответствующие им величины оптической плотности. В местах пересечения значений ставят точку. Калибровочную кривую проводят так, чтобы она прошла через большинство указанных точек, а количество точек, лежащих выше и ниже проведенной кривой, было примерно одинаковым.

Имея калибровочную кривую (рис. 8) легко определить неизвестную концентрацию спермиев любого эякулята. Для этого нужно определить его оптическую плотность на приборе, и установить, какой величине концентрации она соответствует по калибровочной кривой. При этом следует строго соблюдать все условия исследования, при которых выведена калибровочная кривая.

Рис. 8. Калибровочная кривая для определения концентрации спермиев фотоэлектроколориметром

Надо использовать кюветы той же рабочей грани, красный светофильтр. Калибровочную кривую следует ежемесячно калибровать (уточнять), так как точность прибора изменяется (фотоэлементы теряют чувствительность). Для удобства определения концентрации спермиев можно пользоваться таблицами и коэффици- ентами-множителями, которые легко вывести из калибровочной

57

кривой.

Чтобы получить коэффициент-множитель, нужно среднеарифметическую концентрацию 15-20 образцов спермы разделить на соответствующую ей среднеарифметическую величину оптической плотности.

Имея коэффициент-множитель и зная величину оптической плотности эякулята, можно очень легко определить концентрацию спермиев, умножить первую величину на вторую.

Обычно коэффициент-множитель при соблюдении условий на КФК для спермы быка близок к двум, хотя для каждого прибора варьирует.

По точности данный метод не уступает методу подсчета в камере Горяева, величина ошибки ±6%. Метод фотоэлектроколометрии довольно прост по методике выполнения. Высокая чувствительность прибора требует исключительной аккуратности.

Ход работы следующий:

1)включают прибор в сеть за 20 мин до начала работы, открывают кюветное отделение, ручки настройки «грубо» и «точно» устанавливают в крайнее левое положение;

2)устанавливают красный светофильтр;

3) в кюветное отделение устанавливают кюветы с цитратом и кювету с семенем, разбавленным 3,5% раствором цитрата натрия в разведении: для быка – 1:200, барана – 1:400, хряка

ижеребца – 1:30;

4)закрывают кюветное отделение;

5)переключают рукоятку кюветного отделения на кювету с цитратом натрия;

6)устанавливают показания гальванометра по шкале оптической плотности на «0» ручками настройки «грубо» и «точно»;

7)переключают рукоятку кюветного отделения на кювету с семенем;

8)со шкалы оптической плотности считывают результат;

9)определяют концентрацию спермиев по калибровочной кри-

вой.

Погрешности в исследованиях могут быть обусловлены: грязными кюветами и предметами, имеющими контакт со спермой, неточность разбавления спермы перед исследованием, всевозмож-

ными механическими примесями в 3,5% растворе лимоннокислого натрия (непрофильтрованный), загрязнениями оптики прибора,

58