МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего профессионального образования

«КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Кафедра генетики микробиологии и биотехнологии

КУРСОВАЯ РАБОТА №2

Молекулярно-генетические методы для выявления генов устойчивости пшеницы к возбудителям ржавчины

Работу выполнил..............................................................Попов Фёдор Михайлович

Факультет биологический

Направление 020201 Биология

Научный руководитель……………..………………..Карасева Эмма Викторовна

Нормоконтролёр………………………………….…Вяткина Галина Григорьевна

2013

Содержание

Обозначения………………………………………………………………………....5

Введение……………………………………………………………………………..6

1. Аналитический обзор…………………………………………………………….8

2.Материалы и методы……………………………………………………………..14

2.1.Объект исследований……………………………………………………….….14 2.2.Растворы и буферы……………………………………………………………..14

2.3.Выделение и подготовка ДНК к анализу……………………………………..14

2.3.1Экстракция тотальной растительной ДНК………………………………….14

2.4.Полимеразная цепная реакция………………………………………………...16

2.5.Электрофорез………...…………………………………………………………16 3.Молекулярно-генетические методы для выявления генов устойчивости пшеницы к возбудителям ржавчины……………………………………………...18

4.Заключение………………………………………………………..………………29

5.Список использованных источников……………………………………………30

Определения, обозначения, сокращения

ПЦР – Полимеразная цепная реакция

Праймер (англ. primer) — это короткий фрагмент нуклеиновой кислоты (олигонуклеотид), комплементарный ДНК- или РНК-мишени, служит затравкой для синтеза комплементарной цепи с помощью ДНК-полимеразы (при репликации ДНК) праймер F (forward) - комплементарен переднему (5’) концу требуемого фрагмента ДНК

праймер R (reverse) - комплементарен заднему (3’) концу требуемого фрагмента ДНК

К – контроль(ДНК содержащая искомый ген) Кч – контроль чистый - ПЦР смесь не содержащая ДНК

Маркер - линейные фрагменты ДНК известной длины( ДНК «линейка»)

bp -base pair - пара нуклеотидов (оснований). Элементарная единица двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты

CTAB -ЦТАБ Цетилтриметиламмоний бромид

dd – дважды дистиллированый

DNTP mix - Дезоксирибонуклеозидфосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

Master mix – мастер микс – расчетная унифицированная смесь для проведения ПЦР исследования и последующего электрофореза, в расчете 25 мкл р-ра на одну пробирку.

10x buffer – р-р сульфатов и бычий сывороточный альбумин.

TBE - Tris/Borate/EDTA - Трис(гидроксиметил)аминометана / Соли борной кислоты/ Этилендиаминтетрауксусная кислота EDTA – ЭДТА - Этилендиаминтетрауксусная кислота

Введение

В Северо-Кавказском регионе ведущее место в севооборотах хлебных злаков занимает озимая пшеница (3500-4500 тыс.га), что обеспечивает до 20 % валового сбора зерна в России. Эта культура подвержена воздействию большого комплекса фитопатогенов, среди которых возбудители бурой (Puccinia triticina Rob.ex Desm. f.sp. tritici Erikss. et Henn.), желтой ржавчины (Puccinia striiformis West. f.sp. tritici Erikss. еt Henn.), стеблевой ржавчины (Puccinia graminis Pers. f.sp. tritici Erikss. еt Henn.) занимают преобладающее место.

Для разработки научно обоснованной стратегии создания и размещения сортов требуется запас генетически разнообразных доноров устойчивости. Источниками новых доноров могут служить образцы с известными генами устойчивости, представленными в ‹‹Каталоге генных символов…›› (McIntosh et al.,). Традиционными методами идентификации этих генов являются анализ родословной, который позволяет выявить использованный в скрещиваниях источник устойчивости, фитопатологический тест с помощью изолятов, маркированных вирулентностью к идентифицируемому гену, и гибридологический анализ(Методы селекции оценки…1988).

По данным Гультяевой с сотрудниками среди районированных в России 100 озимых и 131 яровых сортов пшеницы обнаружено низкое генетическое разнообразие по эффективным Lr-генам: подавляющее большинство устойчивых сортов несут Lr9 и Lr19 (Гультяева и др., 2009). Однако не было выявлено российских сортов с высоко эффективными возрастным геном Lr37 и проростковыми генами Lr21, Lr25, Lr29 и Lr39, что показывает их значимость для дальнейшего использования в селекции.

В ряде регионов России, в частности на северном Кавказе, эффективны гены устойчивости Lr9, Lr19, Lr24, Lr29, Lr42, а к генам Lr52 (LrW) и Lr45 наблюдается низкая частота встречаемости вирулентных изолятов (около 2-3%) (Volkova, 2009). Тем не менее, к северо-западной российской популяции ген Lr52 неэффективен (Курбанова, 2011). По последним данным изучения вирулентности популяции гриба на Северном Кавказе для селекции в этом регионе предложены гены Lr9 и Lr24 (Кудинова, 2012).

Принципиально новые возможности появились с начала 1990-х годов с созданием ДНК-маркеров селекционно-ценных признаков. Первый молекулярный маркер был предложен G. Schachermayr с соавторами (1994) для идентификации гена устойчивости к бурой ржавчине. Потребности практической селекции определили усиленное развитие исследований по созданию новых маркеров, в связи с чем список предлагаемых генов ежегодно пополняется. Особую значимость ДНК-маркеры приобрели при идентификации 1) высоко эффективных генов устойчивости, определение которых затруднено из-за отсутствия в популяции патогена вирулентных изолятов; 2) генов устойчивости взрослых растений и 3) малоэффективных генов, получивших широкое использование в стратегиях пирамидирования при создании сортов с неспецифической устойчивостью.

Цель работы: провести анализ сортов мягкой пшеницы на наличие генов устойчивости методом ПЦР-анализа.

Задачи работы:

•выявить наличие генов устойчивости пшеницы к ржавчинным заболеваниям

•определить наиболее перспективные сорта пшеницы

1.Аналитический обзор

В начале XX века Н. И. Вавилов начал свою научную деятельность с изучения устойчивых к заболеваниям сортов культурных пшениц. Это была задача чрезвычайной важности, так как от фитопаразитов, в частности ржавчины и мучнистой росы, погибает около 30% урожаев пшеницы. Эти болезни вызываются грибами, их распространение в иные годы приводит к эпифитотиям (по аналогии с эпизоотиями и эпидемиями), когда погибает урожай целых регионов. Вавилов предлагал выявлять природные устойчивые сорта и скрещивать их с культурными, высокопродуктивными растениями. В поисках резистентных сортов Вавилов предпринял несколько экспедиций в Центральную Азию, и в этих экспедициях, как мы помним, сформулировал принципы очагов происхождения культурных растений и законы гомологических рядов. Там же, в очагах происхождения, нашлись и резистентные культурные, и дикие сорта. Далее последовала селекционная работа на опытных полях, и в результате удалось вывести целый ряд устойчивых к заболеваниям сортов культурных растений(Вавилов Н.И.,1986).

Большинство селекционеров и фитопатологов выступают за генетическое разнообразие и против генетической узости сортов. Уязвимость сортов, частые вспышки массовых эпифитотий являются следствием генетической однородности сортов и использования в селекции одних и тех же или ограниченного числа генов устойчивости (Кривченко, 1981).

Урожайность мягкой пшеницы во многом зависит от устойчивости возделываемых сортов к неблагоприятным абиотическим и биотическим факторам, поэтому перед селекционерами стоит задача создания сортов, которые сочетают в себе генетические структуры высокой продуктивности с системами, обеспечивающими минимальные потери урожая от воздействия негативных факторов внешней среды. «Обеспечение комплексной устойчивостью сортов и гибридов к действию биотических и абиотических стрессов должно быть главной целью интегрированных селкционно-агротехнических программ» (Жученко, 2001).

К сожалению, запаса генетического материала самой мягкой пшеницы недостаточно для решения этой проблемы (Feldman, 1983; Sears, 1972; Hope et al., 1984). Более того, ее генофонд был в значительной степени обеднен из-за широкого распространения однотипных сортов с перекрывающимися родословными. В особенности это касается генов устойчивости к болезням, ограничение разнообразия которых является одним из основных лимитирующих факторов селекции (Давоян,2006).

В настоящее время при селекции растений на устойчивость к болезням используются методы гибридизации, мутагенеза и отбора. Селекционерами используются простые и сложные, внутривидовые, межвидовые, отдаленные скрещивания, химические и физические мутагены. Отборы устойчивых генотипов растений проводятся на фонах естественных и искусственных эпифитотий в обычных селекционных посевах и специальных полевых питомниках, в условиях закрытого грунта (теплицы, оранжереи, климатические камеры) и лаборатории(Гешеле, 1978).

Существует два типа устойчивости растений к паразитам: вертикальную и горизонтальную. Вертикальная устойчивость основана на точечном механизме защиты, когда растение прицельно разрушает тот или иной белок гриба-паразита. Эта защита получила название «ген-на-ген» (gene-for-gene), то есть против одного гена паразита работает один защитный ген хозяина.Такая защита обычно чрезвычайно эффективна, но недолговечна. На сегодняшний день известен ряд генов, принимающих участие в горизонтальной резистентности. Среди них гены Lr (leaf rust — листовая ржавчина), которые работают как у проростков, так и у взрослых растений(Van der Plank, 1966; 1972).

В процессе эволюции у растений и их паразитов выработались такие механизмы, которые обеспечивают сохранение генетического материала разнообразия обоих популяций (Генетические основы селекции….1973).

В последнее десятилетие получил развитее подход, объединяющий классическую селекцию и моелкулярно-генетические методы исследования - маркер-вспомогательная селекция (MAS, marker-assisted selection) которая используется в селекционных программах экономически развитых стран в качестве методического приема для интенсификации селекционных процессов (Varshney et al., 2005; Collard, Mackill, 2008). Большое число генов и локусов, контролирующих устойчивость различных видов злаков к биотическим и абиотическим стрессам, признаки урожайности и качества зерна, было идентифицировано и картировано с помощью ДНК-маркеров (Somers, 2004; Landjeva et al., 2007). Ряд селекционных схем, в которых были использованы маркеры, получил теоретическое и практическое обоснование.(Frich et al., 1999; Kuchel et al., 2007, 2008; Herzog, Frich, 2011)

Количественную, или горизонтальную, устойчивость обеспечивают также гены Yr (yellow rust — желтая ржавчина). Имеются работы по выяснению механизмов резистентности. Одна из них, выполненная учеными из США и Израиля под руководством Даолин Фу (Daolin Fu) и Хорхе Дубковски (Jorge Dubcovsky) с кафедры ботаники Калифорнийского университета в Дэвисе, дает информацию о работе гена из семейства Yr (A Kinase-START Gene…,2009). Другая, выполненная международной командой из Цюрихского университета (Швейцария), научно-промышленной исследовательской организации CSIRO Plant Industry (Канберра, Австралия) и Международного центра по разведению кукурузы и пшеницы (Мехико, Мексика), раскрывает механизм работы одного гена из семейства Lr (A Putative…,2009).

Количество эффективных Lr-генов устойчивости к возбудителю бурой листовой ржавчины с каждым годом сокращается (Бабаянц, 1990). Необходим постоянный поиск таких генов.

Считают, что в ряде случаев гену устойчивости растения может соответствовать несколько генов патогенности паразита (Щербаков, 1973). Возможна обратная ситуация, когда один ген патогенности соответствует нескольким генам устойчивости.

Х. Пирсоном был разработан метод идентификации генов устойчивости с помощью «тестирующих» рас патогенов с известной вирулентностью для различных схем хозяин-паразит (Person, 1969). Однако некоторые авторы (Одинцова, Михайлова, 1982) высказали целый ряд ограничений применения этого метода. Рядом исследователей было показано, что гены устойчивости могут быть тесно сцеплены, в т. ч. в сложных локусах (полигенный локус) или близко располагаться в хромосоме с другими генами (Рачинский, Донцев, 1969). При этом в блоки могут входить гены, контролирующие устойчивость к разным болезням. В результате мутации гена в блоке устойчивость к одним болезням может сцеплено наследоваться с восприимчивостью к другим (Щербаков, 1973).

В одинаковых локусах гомологичных хромосом может наблюдаться локализация как одних и тех же генов, так и аллельных, определяющих их различное состояние. Предполагают, что эволюция генов устойчивости растений к болезням происходит постепенно или неожиданно в результате эффекта транслокации (Щербаков, 1970).

При селекции многобарьерных и конвергентных сортов, обладающих различными типами устойчивости, действие малых генов может быть маскировано действием больших генов устойчивости. В этом случае необходимо иметь вирулентные к большим генам расы-биотипы-патотипы, на фоне которых можно выявить действие других генов. Если таких патотипов не имеется, то в процессе селекции можно потерять устойчивость, обусловленную малыми генами. Этот случай был назван Ван дер Планком (1966) «эффектом Вертифолии». Аналогичная необходимость в вирулентных к различным генам устойчивости «тестирующих» расах возникает при конвергентной селекции. При отсутствии таковых можно использовать различные маркеры генов устойчивости (Попереля, Бабаянц, 1978).

Одним из наиболее удобных, быстрых и результативных типов исследований является полимеразная цепная реакция, открытая Кэрри Мюллисом в 1983 году. Она позволяет получить миллионы копий (амплифицировать) интересующего участка ДНК.

Для того, чтобы прошла амплификация, необходимо двухцепочечную ДНК разделить на 2 комплементарных нити. Это достигается путём нагрева до 93-95ºС градусов. Далее необходимо ‹‹присоединить›› праймеры к комплементарным участкам. Для этого нужно снизить температуру до такого уровня, при котором праймер сможет ‹‹прикрепиться›› к комплементарному участку. Такая температура называется температурой ‹‹отжига››, её можно рассчитать по формуле:

t = (A+T)x2 + (G+C)x4 – 5C

После того, как праймер прикрепился к нужному участку, ставится оптимальная температура для работы Taq-полимеразы. Она равна 72 градусам. Следующим шагом будет повторная денатурация ДНК при 93-95 градусах. Допустим, у нас была изначально всего одна ДНК, если мы проведем 35 вышеописанных циклов, мы получим: 1х2³⁴=17179869184 копии.

ДНК-ма́ркеры (ДНК-маркёры) или молекулярно-генетические маркеры, полиморфный признак, выявляемый методами молекулярной биологии на уровне нуклеотидной последовательности ДНК, для определенного гена или для любого другого участка хромосомы при сравнении различных генотипов, особей, пород, сортов, линий.

Селекция с помощью маркеров облегчает отбор устойчивых сортов, основываясь на тесной связи между маркерными аллелями и геном, отвечающим за качественные или количественные признаки, благодаря точной передаче участков хромосомы, несущий интересующий ген (Singh R.P. et al.,2004). По данным исследования CiMMyt (international Maize and Wheat improvement Center), сочетание 4-5 генов устойчивости приводит к высокому уровню вирулентности, равной с иммунностью(Edwards K. et al,1991). Это так же было подтверждено в работе описывающей пирамидирование 5 генов и 2 локусов количественных признаков устойчивости к болезням (Lr19, Lr34, Sr2, Sr26, YrSp, QYr, sgi-7D и QYr.sgi-2B (D.G. Bonnet et al., 2005).

Имеется целый набор современных технологий выявления полиморфизма на уровне ДНК, среди которых можно выделить следующие:

анализ полиморфизма длин рестриктных фрагментов ДНК (RFLP);

анализ полиморфизма с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) предполагает использование специфических праймеров и получение дискретных ДНК-

выявлять маркеры с кодоминантным наследованием и, соответственно, удобен для выявления гетерозигот по данному локусу. Однако, одна пара праймеров для флангов в ПЦР позволяет рассматривать полиморфизм только одного локуса. Для многих микросателлитных локусов не удается выявить полиморфизм. Как правило, фланкирующие последовательности для данного микросателлитного локуса оказываются видоспецифичными.