2.Материалы и методы

Работа была проведена на базе лаборатории иммунитета зерновых культур к грибным болезням ГНУ ВНИИ БЗР.

2.1.Объект исследований

Объектами исследований служили ДНК 40 сортов мягкой пшеницы.

2.2.Растворы и буферы

TBE - Tris/Borate/EDTA - Трис(гидроксиметил)аминометана / Соли борной кислоты/ Этилендиаминтетрауксусная кислота

CTAB - ЦТАБ - Цетилтриметиламмоний бромид

dd Н₂О – дважды дистиллированая очищенная вода

Термостабильная ДНК-полимераза – Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pirococcus furiosus (Pfu-полимераза)

DNTP mix - Дезоксирибонуклеозидфосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

10X buffer – р-р сульфатов и бычий сывороточный альбумин.

Краситель – динитрофенол

Все реактивы приготовлены фирмой «SibEnzyme».

2.3.Выделение и подготовка днк к анализу

2.3.1.Экстракция тотальной растительной днк

ДНК выделяли из листьев 7-дневных проростков микрометодом, как предложено Edwards et al. в модификации Дорохова и Клоке(Дорохов Д.Б.. Клоке Э, 1997).

Концентрация ДНК в рабочем растворе составляла 50-60 нг/мкл.

Экстракция тотальной растительной ДНК происходит в три этапа:

I – Гомогенизация. Самый важный этап, т.к. от него в большей степени зависит общая чистота и легкость получения конечного продукта экстракции. При гомогенизации получается однородная растительная масса.

II – Депротеинизация. Очищение ДНК от белковых компонентов.

III – Осаждение ДНК.

Используем наиболее свежие и молодые образцы пшеницы. (верхушечные листья, которые только начинают расти) с избытком меристематической ткани, т.к. они лучше поддаются гомогенизации и в них соответственно больше ДНК.

I – Механически гомогенизируем растительный материал пестиком в пробирке типа ЭППЕНДОРФ объемом 1,5 мл, добавляем 200 мкл 2%-го р-ра СТАВ, предварительно разогретого до 65С^º, добавляем к полученному гомогенату 250 мкл 2%-го СТАВ и 450 мкл ddН₂О,после чего пробирки с гомогенатом встряхиваем 10 мин при 200 об\мин.

II –. Депротеинизация ДНК

Выдерживаем пробирки с гомогенатами образцов 2 часа в термостате при температуре 65 градусов, добавляем депротеинизирующий раствор (хлороформ) 576 мкл к содержимому пробирок (разогретый гомогенат) и помещаем пробирки на стряхиватель 15 мин при 200 об\мин. После этого центрифугируем их 15 мин при 13.400 об\мин. Отбираем супернатант каждого образца и помещаем его в стерильную пробирку. Полученный в процессе центрифугирования осадок сбрасывается. Добавляем 200 мкл изопропанола к разлитым в новые пробирки супернатантам и помещаем на встряхиватель на 15 мин при 200 об\мин. После этого центрифугируем 15 мин при 13.400 об. в мин. Затем изопропанол сливается из пробирок(на дне должен остаться белесый осадок)

III – Осаждение ДНК.

Добавляем 10 мкл 70%-ного этанола в каждую пробирку с депротеинизированой ДНК, центрифугируем пробирки 5 мин при 13.400 об. в мин. После добавляем 100 мкл 96%-ного этанола в каждую пробиркуи повторно центрифугируем 5 мин при 13.400 об. в мин. Затем сливаем этанол из пробирок(на дне остается белесый осадок) и добавляем в каждую пробирку 100 мкл dd Н₂О стерильной для разведения ДНК.

2.4.Полимеразная цепная реакция.

Для проведения ПЦР требуются следующие компоненты:

•ДНК-матрица

•Два праймера, комплементарные противоположным концам требуемого фрагмента ДНК.

•Термостабильная ДНК-полимераза – фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК– Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pirococcus furiosus (Pfu-полимераза),.

•Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

•Ионы Mg²⁺, необходимые для работы полимеразы.

•10x buffer - обеспечивающий необходимые условия реакции – pH, ионную силу раствора. Содержит сульфаты, бычий сывороточный альбумин.

Проведение ПЦР осуществляли на амплификаторе Eppendorf Mastercycler gradient.

2.5. Электрофорез

Электрофорезом называется разделение чего либо электрическим током, может использоваться для того, чтобы визуализировать результаты проведенной реакции. Электрофорез проводят в геле, он может быть агарозным, или акриламидным. Гель делают на основе раствора электролитов (солей и кислот), как правило это трис-HCL, борная кислота и ЭДТА (TBE). Так как молекулы ДНК заряжены отрицательно, они начинают двигаться в сторону катода. Но, гель представляет для молекул довольно мощную преграду, чем они крупнее по своему размеру, тем труднее им проходить через слой молекул геля. Таким образом, более мелкие молекулы (50 bp) за час электрофореза успевают пройти несколько сантиметров, а более крупные (1000 bp), проходят пару сантиметров. Чтобы наблюдать ДНК, используют бромистый этидий или импрегнируют серебром.

Электрофорез амплификантов ДНК вели в течение 1,5 ч. в 1,5 % агарозном геле, с использованием 0,5x TBE. Напряжение составляло 4В на 1 см камеры. Электрофорез проводили в агарозном геле в горизонтальной камере фирмы «Amersham Biosciences».

Для того чтобы найти нужный нам ген в гель вводят маркер. Маркер - линейные фрагменты ДНК известной длины (ДНК «линейка»)

У разных маркеров эта «длина» различается. Наиболее распространен в исследованиях маркер начинающийся с отметки в 50 пар нуклеотидов. Расчет по нему идет снизу на верх, нижняя черта это 50 пар, следующая 100 пар, затем 150 пар, после 200 пар, затем 300 пар и т.д. На изображении с готового электрофореза (электрофореграмме) проводится горизонтальная линия, отмеряемая по маркерной «линейке» на высоте совпадающей с весом исследуемого гена. И, соответственно те участки ДНК что оказываются выпавшими на этом уровне означают, что в данном образце наличествует искомый ген. Молекулярную массу фрагментов оценивали с помощью маркера 50 bp DNA-labber (Fermentas лит.) для агарозного геля. Затем электрофореграммы фотографировали, и полученные изображения обрабатывали на компьютере в программе FSViever.