Lektsii_po_biofizike_Baskakov_Kapilevich

сигналов, регулирующих пролиферацию и дифференцировку клеток, а также процессы клеточного метаболизма. Особое значение рецепторных тирозинкиназ – участие в опухолевом процессе. Факторы роста продуцируются опухолевой клеткой и действуют на ее же рецепторы (аутокринная регуляция) или соседние клетки (паракринная регуляция).

Рецепторная тирозинкиназа имеет 3 основных домена:

внеклеточный N-концевой участок, который гликолизирован и является агонист-связывающим участком, обеспечивающим специфичность восприятия сигнала;

собственно трансмембранный участок, состоящий из гидрофобных аминокислот;

внутриклеточный тирозиновый домен, аналогичный для всех рецепторных тирозинкиназ.

Рис. 24. Механизмы оперирования мембраносвязанной гуанилатциклазы.

Связывание лиганда в большинстве случаев приводит к димеризации неактивных мономерных рецепторов и к трансаутофосфорилированию тирозиновых остатков цитозольных доменов рецептора. Фосфотирозин рецепторной тирозинкиназы играет ключевую роль в дальнейшей передаче сигнала к внутриклеточным сигнальным молекулам (рис. 23).

Другим примером каталитического рецептора является

мембраносвязанная гуанилатциклаза. Фермент состоит из внеклеточного рецепторного домена, одиночного -спирального трансмембранного сегмента и внутриклеточного каталитического домена. В качестве агонистов этого фермента выступают некоторые биогенные пептиды:

натрийуретический пептид, регулирующий гомеостаз жидкости в организме и кардиососудистую функцию;

91

пептиды, секретируемые яичниками и стимулирующие подвижность сперматозоидов;

термостабильные энтеротоксины из E. сoli.

Связывание этих агонистов с внеклеточным рецепторным доменом приводит к димеризации рецепторов и активации каталитического домена. Субстратом мембранносвязанной гуанилатциклазы является ГТФ, который превращается ферментом в 3’,5’-циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ) (рис. 24).

Вторичные посредники в роли регуляторов клеточной активности

Циклические нуклеотиды в роли вторичных посредников

Первым соединением, которое получило статус вторичного посредника, был 3’,5’-циклический аденозинмонофосфат (цАМФ), открытый Е. Сазерлендом в 50-х годах ХХ века в ходе работ по выяснению механизма стимуляции гликогенолиза адреналином. После открытия цАМФ был обнаружен фермент, катализирующий превращение АТФ в цАМФ в присутствии ионов Mg2+ (аденилатциклаза) (рис. 25), а также фермент, осуществляющий инактивацию цАМФ путем превращения его в 5’-АМФ (фосфодиэстераза).

Оказалось, что кроме гликогенолиза существует множество процессов, осуществляемых в разных клетках при участии цАМФ. Приведем некоторые примеры биологических эффектов цАМФ:

Изменение проницаемости мембран

Синтез стероидных гормонов корой надпочечников

Секреторные реакции экзо- и эндокринных желез

Транскрипция генов

Перемещение внутриклеточных структур

Подвижность и агрегация у одноклеточных организмов

Вначале «эры» цАМФ Е.Сазерленд с соавторами выработали критерии, на основании которых устанавливается участие этого соединения в ответе клетки на химическую стимуляцию. Другими словами, были сформулированы критерии вторичного посредника, которые можно распространить и на другие сигнальные внутриклеточные молекулы.

1.Химический агент должен стимулировать активность аденилатциклазы в препаратах чувствительной ткани.

2.В ответ на действие химического агента должна возрастать концентрация цАМФ в ткани.

3.Косвенное доказательство участия цАМФ в реакции – потенцирование гормонального эффекта ингибиторами фосфодиэстеразы.

4.Воспроизведение гормонального эффекта с помощью цАМФ или его производного (например, дибутирил-цАМФ).

92

5.Повышение концентрации цАМФ в ткани под влиянием гормона

должно предшествовать регистрируемой биологической реакции. Внутриклеточная концентрация цАМФ определяется не только скоростью наработки этого посредника, но и скоростью его распада. Последнюю реакцию катализирует фосфодиэстераза циклических нуклеотидов

(ФДЭ).

Рис. 25. Образование циклического аденозинмонофосфата.

Аденилатциклаза представляет собой интегральный белок, полипептидная цепь которого образует 12 гидрофобных доменов, встроенных в цитоплазматическую мембрану. Активация фермента происходит в результате взаимодействия с -субъединицей стимулирующего (Gs) ГТФ-связывающего белка. Примером рецепторов, активирующих аденилатциклазу через стимулирующий ГТФ-связывающий белок, являются -адренергические рецепторы. α2-Адренергические рецепторы связаны с ингибирующим (Gi ) ГТФ-связывающим белком (рис. 26).

Механизм влияния Gi-белка на АЦ до конца не выяснен. Есть данные, что он связан с конкурентным ингибированием a-субъединицы за счет избытка β - субъединиц. Установлено, что Gs- и Gi-белки имеют аналогичные субъединицы β , но a-субъединица Gi-белка не способна активировать АЦ.

Некоторые вещества способны модулировать состояние G-белков. Холерный и коклюшный токсины делают это за счет рибозилирования (с.88). Повышают активность G-белков и негидролизуемые аналоги ГТФ (в частности GTP- -S), а также комплексное соединение [AlF4]-, образующееяся в клетке при добавлении в среду инкубации NaF и AlCl3.

Распад цАМФ зависит от активности фосфодиэстеразы, которая, в свою очередь, контролируется ионами Са2+ и кальмодулином.

Увеличение цАМФ в клетке приводит к активации цАМФ-зависимой протеинкиназы (протеинкиназа А). В неактивной форме этот фермент представляет собой тетрамерный белок, состоящий из двух регуляторных (R) и двух каталитических (С) субъединиц. Каталитические субъединицы приобретают активность только после диссоциации комплекса, которая

93

происходит вследствие присоединения 4 молекул цАМФ к 2 регуляторным субъединицам (рис. 27):

Рис. 26. Организация цАМФ-зависимой сигнальной системы.

R2C2 + 4цАМФ (R цАМФ2)2 + 2С

неактивная форма

активная форма

Рис. 27. Механизм активации ПК-А.

Субстратами для протеинкиназы А могут быть белки ионных каналов, ионообменников, транспортных АТФ-аз, цитоскелета, ферменты, белки рибосом, ядерные белки и др. Все эти субстраты будут фосфорилироваться протеникиназой А по остаткам серина и треонина. Фосфорилирование белков будет изменять их активность как в сторону увеличения, так и уменьшения.

На функциональное состояние цАМФ-зависимой сигнальной системы способны оказывать влияние вещества различной природы. Дитерпен растительного происхождения форсколин непосредственно активирует АЦ. Ингибиторы фосфодиэстеразы потенциируют эффекты цАМФ, замедляя процесс его распада. Получены синтетические соединения, способные модулировать активность ПК-А. Все названные вещества находят применение в изучении физиологии цАМФ-зависимой сигнальной системы, некоторые используются как лекарственные вещества (спазмолитики группы теофилина, папаверин).

В качестве вторичного посредника может выступать другой циклический нуклеотид, а именно цГМФ. Он образуется из ГТФ с помощью фермента

94

гуанилатциклазы. По сравнению с цАМФ-зависимыми путями регуляции цГМФ-опосредованные распространены гораздо меньше. Содержание цГМФ в клетке примерно в 10 раз ниже, чем цАМФ.

Вклетках обнаружено две формы гуанилатциклазы – мембраносвязанная

ирастворимая (цитозольная). Рассмотрим оба пути образования цГМФ к клетке.

Первый путь связан с действием агонистов на соответствующий рецептор, который связан с гуанилатциклазой (см. классификацию рецепторов). В этом случае ГТФ-связывающие белки не участвуют в пути передачи сигнала, поскольку рецептор и гуанилатциклаза являются доменами одного и того же белка. Рецепторный домен расположен на внешней стороне мембраны, а каталитический – на ее внутренней стороне. При связывании агониста с рецептором всегда происходят активация мембраносвязанной гуанилатциклазы

инаработка цГМФ. Циклический ГМФ связывается с цГМФ-зависимой протеинкиназой, который, как и протенкиназа А, относится к серинтреониновым протеникиназам. В неактивном состоянии этот фермент состоит из 2 субъединиц, которые имеют по 2 регуляторных центра. Для активации цГМФ-зависимой протеинкиназы необходимо 4 молекулы цГМФ, но при этом, в отличие от протеинкиназы А, не происходит диссоциации субъединиц.

Рис. 28. Физиологические эффекты гуанилатциклазы.

Примером агониста, активирующим мембранносвязанную форму гуанилатциклазы, является натрий-уретический пептид, который секретируется клетками предсердий. Он действует на гладкомышечные клетки сосудов, вызывая их расслабление. В почках этот фактор снижает реабсорбцию Na+ , что увеличивает его выход с мочой.

Второй путь регуляции, опосредованный цГМФ, связан с растворимой формой гуанилатциклазы. Ее активация не зависит от взаимодействия агониста и рецептора, а осуществляется с помощью оксида азота (NO). В 80-е годы ХХ века обнаружили, что именно это соединение выступает в роли эндотелиального фактора релаксации сосудов.

95

Впоследствии оказалось, что NO участвует в большом числе разнообразных клеточных реакций. Многообразные роли оксида азота в организме приведены на схеме (рис. 28).

NO вырабатывается во многих клетках организма, но существует три категории клеток, в которых эта молекула также реализует свои функции:

1)эндотелиальные клетки, вырабатывающие NO, который вызывает расслабление гладкомышечных клеток сосудов;

2)клетки ЦНС, где NO участвует в передаче сигнала;

3)клетки иммунной системы, в которых NO участвует в иммунном

ответе.

Эндогенный NO образуется из L-аргигина под действием NO-синтазы. Различают две формы NO-синтазы: конститутивную и индуцибельную. Различия этих ферментов приведены в таблице 4.

Рассмотрим особенности растворимой формы гуанилатциклазы. Этот фермент является сульфгидрильным белком, содержащим на своей поверхности лабильные SH-группы, которые легко окисляются. Кроме того, растворимая гуанилатциклаза – это гем-содержащий фермент. Именно гем отвечает за связывание с молекулой NO, что переводит фермент в активное состояние.

Увеличение концентрации цГМФ в клетке вследствие активации растворимой гуанилатциклазы приводит, в свою очередь, к активации цГМФзависимой протеинкиназы (рис. 29). Последняя, фосфорилируя белки клетки, изменяет ее функционирование. Перевод цГМФ в нециклическую форму осуществляет фермент фосфодиэстераза.

	Таблица 4
Характристика разновидностей гуанилатциклазы
	ИНДУЦИБЕЛЬНАЯ ФОРМА NO-
КОНСТИТУТИВНАЯ ФОРМА NO-	СИНТАЗЫ
СИНТАЗЫ
Активность фермента зависит от ионов	Активность фермента не зависит от
кальция	ионов кальция
Фермент постоянно активен	Фермент активируется в определенных
	обстоятельствах
Продукция NO невелика (несколько	NO вырабатывается в больших
ммоль/л)	количествах (сотни ммоль/л)
Фермент локализован в эндотелиальных	Фермент локализован в
и нейрональных клетках	иммунокомпетентных клетках
	(макрофаги)

96

Рис. 29. Организация цГМФ-зависимой сигнальной системы.

Ионы кальция в роли вторичных посредников

О роли ионов кальция как вторичных посредников впервые заговорил Расмуссен. Сначала остановимся на вопросе, почему именно ионы кальция выступают в этой роли. Как известно, между клеткой и средой существует высокий градиент ионов кальция: его внутриклеточная концентрация составляет в среднем 10–7 М, а внеклеточная – 10– 3 М. Таким образом, на мембране клетки существует градиент ионов кальция 1:10000. Вследствие действия биологически активных веществ концентрация кальция внутри клетки может быть быстро увеличена до 0,6–2 мкМ. Увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция достигается за счет открывания кальциевых каналов разного типа, мобилизации ионов кальция из внутриклеточных депо (ЭПР, митохондрии), торможения оттока ионов кальция из клетки, который осуществляется Са2+-АТФ-азой.

Свое действие внутри клетки ионы кальция могут реализовывать различными путями.

Первый путь кальциевой регуляции характеризуется взаимодействием ионов кальция с кальций-связывающими белками, что изменяет активность клетки. Среди таких белков можно выделить несколько групп.

1. Кальций-связывающие белки, обладающие ферментативной активностью. Примером таких белков является мультисубстратная протеаза кальпаин, которая осуществляет ограниченный протеолиз многих белков, например белков цитоскелета, ядерных структурных белков, многих ферментов, транспортных белков. Кальпаин вовлечен в реализацию как относительно узкоспецифичных функций (например, секреция соляной

97

кислоты в желудке), так и таких основополагающих, как клеточная пролиферация и дифференцировка, эмбриогенез, апоптоз.

2.Кальций-фосфолипид-связывающие белки – аннексин В. Эти белки участвуют в процессах слияния и агрегации мембран и осуществляют контроль за пролиферацией и дифференцировкой клеток.

3.Кальций-запасающие белки, которые, связывая ионы кальция, пассивно (в отличие от активного транспорта ионов кальция с помощью кальциевого насоса) изменяют его концентрацию внутри клетки. Примерами служат кальсеквестрин, содержащийся в поперечно-полосатых мышечных волокнах, кальретикулин, находящийся в ретикулуме.

4.Кальций-связывающие белки, входящие в состав ионных каналов. Примером может служить Са2+-активируемый калиевый канал, который открывается вследствие увеличения концентрации ионов кальция внутри клетки.

5.Кальций-связывающие белки, не обладающие ферментативной активностью, но регулирующие многие ферменты клетки. Наиболее известным

среди таких белков является кальмодулин. Кальмодулин имеет 4 участка связывания с ионами кальция (рис. 30). Комплекс Са2+-кальмодулин (Са-СаМ) изменяет активность фермента двумя путями: либо прямо взаимодействуя с ферментом-мишенью, либо активируя Са-СаМ-зависимую протеинкиназу. Примерами Са-СаМ-зависимых ферментов являются фосфодиэстераза

циклических нуклеотидов, киназа легких цепей миозина, аденилатциклаза, фосфолипаза А2, Са2+-АТФ-аза.

Рис. 30. Организация Са2+-КМ-зависимой сигнальной системы.

Наличие 4 неэквивалентных связывающих участков, каждый из которых может быть вакантным, оккупированным ионами кальция, магния или калия, допускает существование 44=256 разновидностей комплекса металлкальмодулин. Анализ различных комбинаций этих комплексов с помощью компьютерного моделирования привел авторов к заключению, что количество физиологически значимых разновидностей металл-кальмодулиновых соединений все же невелико: для состояния "покоя" клетки – МККК, ММКК,

МММК, а для возбужденного – ССМК, СССК, ССММ, СМКК, СММК, ССКК

98

(где С – ионы кальция, М – магния и К – калия). Молярное соотношение Са/КМ определяет приоритетность отдельных конформеров и активацию (запуск) соответствующих ферментов (процессов).

Предложено несколько схем взаимодействия КМ с ионами кальция и исполнительной системой (ферментом). Одна из них, схема C.Huang, приведена ниже.

Согласно этой модели, первая стадия – взаимодействие первого иона кальция с КМ ведет к конформационным изменениям молекулы, вследствие чего облегчается (увеличивается сродство) присоединение второго иона. Связывание второго иона обусловливает выраженный конформационный переход молекулы и резкое (70-кратное) увеличение сродства комплекса СаКМ к ферменту-исполнителю. Образование такого четвертичного комплекса, обладающего низкой ферментативной активностью, еще больше (в 150 раз) повышает сродство третьего и четвертого связывающих участков к ионам кальция, координирование в которых последних переводит комплекс в активное состояние.

Выявлен ряд веществ, способных ингибировать КМ-зависимые реакции. В настоящее время список так называемых "низкоаффинных" ингибиторов (Кd=1- 10 мкМ) включает более 50 наименований. Из всего многообразия этих фармакологических агентов можно выделить две группы соединений, наиболее часто использующихся в экспериментальной практике, – препараты фенотиазинового ряда и производные нафталенсульфоната.

Производные фенотиазина были первыми соединениями, для которых установлена способность угнетать КМ-зависимые процессы. В присутствии ионов кальция с КМ связываются две молекулы трифторперазина с Kd=1-1,5 мкМ и вызывают структурные изменения молекулы белка: увеличивается полярность участков, приближенных к растворителю, повышается подвижность сорбированного катиона и сродство КМ к ионам кальция. Механизм ингибирующего действия производных фенотиазина обусловлен связыванием с гидрофобными участками КМ, экспонирующимися при взаимодействии белка с ионами кальция, и нарушением его гидрофобных взаимодействий с исполнительной системой. Вместе с тем не исключается и участие электростатических взаимодействий молекул ингибиторов с КМ.

Механизм ингибирующего действия производных нафталенсульфоната, из которых наибольшее распространение получило соединение W-7, также связан с нарушением гидрофобных взаимодействий между комплексом Са-КМ и белком-исполнителем.

В последние годы для исследования кальмодулин-зависимых процессов широко применяется антибиотик R24571 (кальмидозолиум), который обладает наибольшей эффективностью (Kd= 0,5 мкМ) среди перечисленных антагонстов КМ. Следует также отметить, что кальмодулин-зависимые реакции угнетаются и рядом соединений, которые традиционно используются для воздействия на другие регуляторные системы. Среди них антагонисты входа ионов кальция, блокаторы a- и b-адренергических рецепторов, местные анестетики, цитостатики, некоторые физиологически активные пептиды и т.п.

99

Сигнальная система, связанная с метаболизмом мембранных фосфоинозитидов

Во многих клетках увеличению внутриклеточной концентрации ионов кальция предшествует активация фосфолипазы С. Фосфолипаза С может быть активирована вследствие взаимодействия агонистов с рецепторами, ассоциированными либо с ГТФ-связывающими белками, либо с тирозинкиназой. Фосфолипаза С осуществляет гидролиз фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфата до инозитол 1,4,5-трифосфата (ИФ3) и диацилглицерола (ДАГ). ИФ3 диффундирует в цитоплазму к ЭПР, связывается с соответствующим рецептором и вызывает открывание кальциевых каналов и выход ионов кальция в цитозоль клетки. ДАГ вместе с ионами кальция активирует специфическую протеинкиназу – кальций-фосфолипид-зависимую протеинкиназу (протеинкиназу С) (рис. 31).

Протеинкиназа С фосфорилирует многие белки по остаткам серина и треонина, вызывая разнообразные биологические эффекты. Примерами таковых могут служить секреция, сокращение гладкомышечных клеток, агрегация тромбоцитов и др.

Рис. 31. Организация ФИ-зависимой сигнальной системы.

Протеинкиназа С (ПК-С) была обнаружена во многих тканях. В состоянии покоя она присутствует в клетке в основном в неактивной, растворенной в цитоплазме форме. Агонист-стмулированное образование ДАГ, который вследствие своей гидрофобности накапливается в мембране, индуцирует переход ПК-С в активную, тесно связанную с мембраной форму. Эффект ДАГ состоит в повышении сродства ПК С для ионов кальция, так что фермент может быть активирован без каких-либо изменений уровня цитоплазматического кальция. В условиях in vitro ПК-С обладает широкой субстратной специфичностью и фосфорилирует сериловые и треониловые (но не тирозиловые) остатки многих мембранных и цитоплазматических белков.

100