1. Инфузионные среды
Инфузионные среды – препараты, применяемые для парентеральной жидкостной терапии.
Все инфузионные среды, или растворы, в зависимости от свойств и назначения делятся на следующие группы:
1) коллоидные инфузионные растворы – гетерогенные и аутогенные (растворы декстрана, желатина, крахмала, препараты крови и кровь);
2) кристаллоидные инфузионные растворы – растворы электролитов и Сахаров;
3) дезинтоксикационные растворы – специфическая группа низкомолекулярных коллоидов, обладающих дезинтоксикационным свойством;
4) растворы, обладающие полифункциональным действием;
5) кровезаменители с газотранспортной функцией – растворы, способные выполнять функцию транспорта кислорода и углекислого газа без участия эритроцитов;
6) препараты для парентерального питания.
2. Коллоидные инфузионные растворы
Гетерогенные
Декстран. Декстран вырабатывается микробами на сахарсодержащих средах и является водорастворимым высокомолекулярным полимером глюкозы. В 1943 г. путем гидролиза нативного декстрана была получена фракция "макродекс", водные растворы которой по свойствам были близки плазме крови. Декстран быстро распространился по всему миру и уже в 1953 г. в СССР был получен раствор декстрана, названный полиглюкином.
Полиглюкин. Полиглюкин – 6% раствор декстрана со средней мол. массой 50000–70000. В его состав входят декстран среднемолекулярный (6 г), хлорид натрия (9 г), этиловый спирт (0,3%), вода для инъекций (до 1000 мл). Относительная вязкость 2,8–4; КОД – 58 мм рт.ст., рН 4,5–6,5; осмолярность – 308 мосм/л. Зарубежные аналоги – макродекс, интрадекс, инфукол и др. имеют среднюю мол. массу от 60000 до 85000.
Большая молекулярная масса и высокое КОД полиглюкина обеспечивают удержание его в сосудах и увеличение ОЦП. Молекулы полиглюкина длительно удерживаются в сосудистом русле и оказывают выраженное гемодинамическое действие. При шоке среднемолекулярные декстраны оказывают положительное влияние на кровообращение в течение 5–7 часов. При дефиците объема крови до 1 л полиглюкин или макродекс можно применить в качестве единственного средства для лечения гиповолемии. Низкомолекулярная фракция полиглюкина оказывает положительное действие на реологические свойства крови и улучшает микроциркуляцию.
Сразу же после инфузии полиглюкин начинает покидать сосудистое русло. Основная же его масса выделяется с мочой в неизменном виде в течение первых суток.
Полиглюкин показан во всех случаях острой гиповолемии. Разовая доза от 400 до 1000 мл и более. Доза и скорость введения зависят от конкретной ситуации. Максимальной дозой декстранов 60–85 является 1,5–2 г/кг в сутки. Превышение этой дозы может сопровождаться кровоточивостью. Несмотря на то, что растворы полиглюкина нетоксичны и апирогенны, их введение может сопровождаться аллергическими и анафилактическими реакциями. Для их предотвращения следует проводить такую же биологическую пробу, как и при введении цельной крови. Для этой же цели может быть использован моновалентный декстран 1 (Фрезениус) в дозе 20 мл в течение 2 минут. Однако важнейшим условием профилактики является создание декстранов с узконаправленным действием, не содержащих высокомолекулярных фракций.
К этой же группе препаратов относят полифер (близкий аналог полиглюкина, который предназначается для терапии гиповолемических состояний и стимуляции гемопоэза), рондекс (обладает улучшенными функциональными характеристиками по сравнению с полиглюкином, относительная вязкость его не превышает 2,8; нормализует центральную гемодинамику, улучшает периферическое кровообращение и подавляет адгезивные свойства тромбоцитов), полиглюсоль (создан на основе полиэлектролитного раствора).
Все среднемолекулярные растворы декстрана выполняют главным образом объемозамещающую функцию, воздействуя на центральную гемодинамику. Однако острая потеря крови или плазмы сопровождается и нарушениями периферического кровообращения, что требует коррекции реологических характеристик крови. К препаратам реологического действия относят низкомолекулярные декстраны.
Реополиглюкин. Реополиглюкин – 10% коллоидный раствор декстрана со средней мол. массой 30000–40000. В его состав входят декстран низкомолекулярный (100 г.), хлорид натрия (9 г), глюкоза (60 г.), вода для инъекций до 1000 мл. Относительная вязкость – 4–5,5; рН 4–6,5. Осмолярность препарата на 0,9% растворе хлорида натрия 308 мосм/л и 667 мосм/л, если препарат на 0,9% растворе хлорида натрия с глюкозой.
Декстраны с молекулярной массой 40000 и ниже относятся к группе низкомолекулярных декстранов. Они обеспечивают наибольший, но кратковременный эффект. Благодаря высокой концентрации низкомолекулярные декстраны обладают быстрым и мощным экспандерным действием. Сила связывания воды превышает физиологическую силу связывания с белками крови, что приводит к перемещению жидкости из интерстициального сектора в сосудистый, 1 г реополиглюкина связывает 20–25 мл воды. Увеличение объема плазмы при применении декстрана 40 наиболее выражено в первые 90 минут после введения. Волемический коэффициент реополиглюкина около 1,4. Через 6 часов после инфузии содержание реополиглюкина в крови уменьшается примерно в 2 раза, в первые сутки с мочой выводится до 80% препарата. Реополиглюкин оказывает выраженное дезагрегационное действие на тромбоциты. Он образует молекулярный слой на поверхности форменных элементов крови, клеточных мембранах и эндотелии сосудов, что уменьшает опасность внутрисосудистого свертывания крови и развития ДВС-синдрома. Отрицательной стороной этого действия является возможность развития кровотечения. Опасность такого осложнения возрастает при назначении больших доз как низко-, так и среднемолекулярных декстранов (более 1,5 л для взрослых).
Показания к назначению реополиглюкина: нарушения микроциркуляции, независимо от этиологии (шок, ожоговая травма в остром периоде, сепсис и т.д.), склонность к гиперкоагуляции и тромбозам.
Анафилактоидные реакции и другие осложнения при вливаниях реополиглюкина бывают редко и обычно легко устраняются "стандартной" терапией.
Зарубежные аналоги реополиглюкина: реомакродекс, лонгастерил-40, реофузин, реодекс и другие отличаются от отечественных составом солей и более узким молекулярным распределением фракций.
Желатин. Желатин – высокомолекулярное водорастворимое вещество животного происхождения, не являющееся полноценным белком. В отличие от других белков он не обладает специфичностью и поэтому применяется как кровезаменитель.
Желатиноль. Желатиноль – 8% раствор частично гидролизованного пищевого желатина. Содержит пептиды различной молекулярной массы. Средняя мол. масса его 20000. Относительная вязкость 2,4–3,5; плотность 1,035; КОД 220–290 мм вод. ст.; рН 6,7–7,2.
Механизм действия желатиноля обусловлен его коллоидными свойствами. Сила связывания воды у растворов желатина меньше, чем у декстранов, экспандерное действие нехарактерно. Активное действие продолжается всего несколько часов. Через 24 часа в крови остаются лишь следы желатиноля. Растворы желатина обладают меньшей по сравнению с декстраном объемозамещающей способностью, волемический коэффициент 0,5. Они быстрее распределяются во внеклеточном пространстве, благодаря чему менее опасны в смысле возможности перегрузки сердца. При введении желатиноля возникает эффект гемодилюции без нарушения свертывания крови. Введение желатиноля показано при гиповолемии, в том числе больным с нарушениями свертывания крови. Частично расщепленный желатин выводится почти весь через почки. При введении желатиноля развивается полиурия с относительно низкой плотностью мочи и ускоряется выведение токсических метаболитов. Непременным условием для реализации этого дезинтоксикационного действия является достаточная выделительная функция почек. Некоторая часть введенного желатиноля способна расщепляться и образовывать небольшое количество энергии.
Зарубежные аналоги: плазмагель, геможель, неоплазмажель, физиогель; гелифундол, гемацель, модифицированная жидкая желатина (МФЖ) и др.
Крахмал. В последние годы нашли широкое распространение кровезаменители растительного происхождения, созданные на основе оксиэтилированного крахмала путем частичного гидролиза кукурузного крахмала. Эти препараты нетоксичны, не оказывают отрицательного действия на коагуляцию крови и не вызывают аллергических реакций. Они имеют тесное структурное сродство с гликогеном, что объясняет высокую переносимость оксиэтилкрахмала организмом. Способны расщепляться с освобождением незамещенной глюкозы. В отличие от декстранов молекулярная масса оксиэтилкрахмала значительно выше, но это не имеет существенного значения в оценке его свойств. По своему гемодинамическому и противошоковому действию растворы крахмала схожи с декстранами. Продолжительность циркуляции и волемические свойства оксиэтилкрахмала зависят от молекулярной массы и степени замещения. Так, при степени замещения 0,7 каждые 10 единиц глюкозы содержат 7 гидроксиэтиловых групп. При степени замещения, равной 0,7, полупериод выведения препарата до 2 суток при 0,6–10 часов, а при 0,4–0,55 – еще меньше. Коллоидное действие 6% гидроксиэтилового крахмала сходно с человеческим альбумином. После инфузии 1 л плазмастерила (молекулярная масса 450000, степень замещения 0,7) повышение объема плазмы продолжается более 6–8 часов. Инфузии растворов крахмала, в частности плазмастерила, способствуют снижению системного и пульмонального периферического сосудистого сопротивления. В противоположность гетерогенным коллоидным растворам и подобно человеческому альбумину 6% гидроксиэтиловый крахмал очень незначительно повышает среднее легочное давление, обеспечивая при этом значительное увеличение систолического объема сердца. Плазмастерил вызывает легкое замедление свертывания крови в рамках физиологических параметров и противодействует послеоперационной патологической гиперкоагуляции. Инфузии плазмастерила вызывают активизацию функции почек и стимулируют диурез.
В настоящее время разработаны и широко применяются, особенно за рубежом, растворы (3%, 6%, 10%) среднемолекулярного гидрооксиэтилового крахмала с молекулярной массой 200000 и степенью замещения 0,5. Уменьшение молекулярной массы и степени замещения сокращает время циркуляции раствора в плазме. Повышение коллоидной концентрации способствует усилению начального эффекта объема. Благодаря среднемолекулярному характеру коллоида можно не опасаться значительного гиперонкотического эффекта. В силу специфических реологических и антитромботических свойств эти среды оказывают положительное влияние на микроциркуляцию, нормализуют тромбоцитное и плазматическое свертывание, не увеличивая опасность кровотечения. Все сказанное позволяет рекомендовать препараты гидрооксиэтилкрахмала к широкому применению не только для профилактики и лечения дефицита объема и шока, но и для профилактики тромбоэмболий и лечения периферических нарушений кровообращения.
Волекам – отечественный препарат, созданный на основе оксиэтилированного крахмала. Его мол. масса 170000 и степень замещения 0,55–0,7. По свойствам он близок японскому препарату.
Плазмастерил ("Фрезениус") – 6% гидрооксиэтиловый крахмал, мол. масса 450 000, степень замещения 0,7.
HAES-стерил ("Фрезениус") – раствор среднемолекулярного гидрооксиэтилового крахмала. Молекулярная масса 200000, степень замещения 0,5.
Аутогенные
К аутогенным коллоидным растворам относятся плазма, альбумин, протеин и кровь.
Плазма крови содержит 90% воды, 7–8% белка, 1,1% небелковых органических веществ и 0,9% – неорганических. Основную массу плазмы составляют альбумины.
Нативная плазма. Несмотря на все показания, применение нативной плазмы сдерживается малым сроком ее хранения (до суток), возможностью инфицирования вирусами гепатита В и СПИДа.
Свежезамороженная плазма имеет ряд преимуществ по сравнению с нативной плазмой. Может храниться при температуре –30°С в течение года в герметичной упаковке. Свободна от недостатков плазмы и содержит фактически все факторы системы гемостаза.
Показаниями к применению свежезамороженной плазмы служат массивная кровопотеря и плазмопотеря, все стадии ожоговой болезни, гнойно-септические процессы, тяжелая травма, синдром сдавления с угрозой развития ОПН. Является препаратом выбора при ДВС-синдроме. Переливание свежезамороженной плазмы показано при коагулопатиях с дефицитом II, V, VII, XIII факторов свертывания, при гепаринотерапии в лечении тромбозов. Применение больших объемов свежезамороженной плазмы является неотъемлемой частью интенсивной терапии тяжелой травмы, синдрома сдавления. По сравнению с другими аутогенными коллоидными растворами свежезамороженная плазма – наиболее расходуемый компонент в период оказания экстренной медицинской помощи в очагах стихийных бедствий.
Попадание в кровь активаторов свертывания крови из разрушенных тканей является реальной угрозой развития ОПН. В этих случаях показано возможно раннее применение свежезамороженной плазмы, несущей факторы антисвертывающей системы, естественные антиагреганты и плазминоген. Свежезамороженная плазма – высокоэффективная коллоидная среда гемодинамического действия. Этот компонент крови наиболее полноценно возмещает потери различных видов белков. Может быть использован во время лечебного плазмафереза.
Доза инфузируемой плазмы определяется патологией и колеблется от 100 мл до 2 л в сутки и более. Перед переливанием свежезамороженную плазму оттаивают в водяной бане при температуре 35–37°С. Она должна быть прозрачной, соломенно-желтого цвета, без мути, хлопьев и нитей фибрина. Ее следует переливать немедленно. Скорость введения от капельного до струйного. Она должна быть одной группы с кровью больного. Обязательна биологическая проба: струйное вливание первых 10–15 мл плазмы, наблюдение за состоянием больного в течение 3 минут; при отсутствии изменений в состоянии больного – повторное струйное вливание 10–15 мл плазмы и наблюдение в течение 3 минут: если нет реакции пробу проводят в третий раз. Если ни на одну из проб больной не отреагировал ни субъективно, ни объективно, то проба считается отрицательной, и переливание плазмы можно продолжить. Противопоказанием к назначению растворов плазмы служит сенсибилизация больного к парентеральному введению белка.
Концентрированная нативная плазма обладает более выраженными гемостатическими свойствами. Средние дозы при кровотечениях составляют 5–10 мл/кг/сут; при дефиците белка – по 125–150 мл/сут с 2–3-дневными перерывами.
Антистафилококковую человеческую плазму применяют для лечения гнойно-септических осложнений, вызванных кокковой патогенной флорой.
Альбумин представляет собой фракционированный препарат плазмы человека. Выпускается во флаконах в 5%, 10% и 20% растворе.
Альбумин крови является основным циркулирующим мелкодисперсным белком. Его молекулярная масса 68 000–70 000. Альбумин поддерживает высокое КОД крови и способствует привлечению и удерживанию тканевой жидкости в сосудистом русле. По своему осмотическому давлению 1 г альбумина равноценен 18 мл жидкой плазмы, 25 г. альбумина эквивалентны 500 мл плазмы.
Альбумин участвует в обмене между кровью и тканями, является резервом белкового питания и универсальным средством транспорта ферментов, гормонов, токсинов и лекарственных средств. Он играет основную роль в поддержании КОД плазмы, поэтому особенно необходим при снижении объема плазмы, вызванном гипоальбуминемией; 5% раствор альбумина дает такое же онкотическое давление, как и плазма. Чем выше концентрация раствора, тем больше его объемозамещающее действие. Действие 100 мл 20% раствора альбумина приблизительно соответствует действию 400 мл плазмы. При дегидратации введение 10% и 20% раствора альбумина необходимо сочетать с введением 2–3-кратных объемов кристаллоидных растворов.
Показания к назначению растворов альбумина: острая кровопотеря и плазмопотеря, снижение объема плазмы, катаболизм белка и особенно гипоальбуминемия. Скорость введения колеблется от очень медленного темпа инфузий до струйного введения. При умеренной гипоальбуминемии общая суточная доза составляет 100–200 мл 5% или 10% раствора. При более значительных потерях белка и гиповолемии суточная доза может быть увеличена до 400, 600 и даже 1000 мл. Рекомендуется проводить биологическую пробу.
Протеин – это пастеризованный 4,3–4,8% раствор белков плазмы, в состав которого входят альбумины (75–80%), глобулины (20–25%) с добавлением альбумината трехвалентного железа и эритропоэтических веществ. По своим свойствам протеин занимает промежуточное положение между плазмой и альбумином. Инфузии раствора протеина могут сопровождаться аллергическими реакциями, поэтому следует проводить биологическую пробу и соблюдать медленный темп инфузий.
Кровь в отличие от других препаратов объемозамещающего действия дает ограниченный гемодинамический эффект. При трансфузии цельной крови и эритроцитной массы повышается гемоконцентрация, которая ухудшает капиллярный кровоток, особенно при шоке и низком АД. Депонирование в капиллярном русле может создать непреодолимое сопротивление кровотоку. К факторам, ограничивающим применение крови как основной среды при кровопотере и шоке, относятся опасность развития сенсибилизации, реакция непереносимости, ацидоз, вызываемый гипераммониемией, повышение концентрации калия в крови, нарушение свертываемости и возможность вирусных инфекций.
В экстренных случаях трансфузию крови производят с целью предупредить опасное снижение глобулярного объема и развитие связанных с ним нарушений кислородтранспортной функции крови. Абсолютным показанием к переливанию крови является снижение Ht до 0,25–0,20. Показанием к переливанию цельной донорской крови является острая массивная кровопотеря при отсутствии компонентов крови, таких как эритроцитная масса, отмытые эритроциты, свежезамороженная плазма. Во всех случаях острой постгеморрагической анемии, возникшей в результате травмы, желудочно-кишечных кровотечений, операций и т.д. показано переливание эритроцитной массы. Переливание отмытых эритроцитов предпочтительно при анемических состояниях у больных, сенсибилизированных повторными переливаниями крови; у пациентов с отягощенным аллергоанамнезом; при синдроме гомологической крови. Переливание тромбоцитной массы производят при массивной кровопотере и массивном кровозамещении, при геморрагическом диатезе, вызванном глубокой тромбоцитопенией; в третьей стадии ДВС-синдрома. Показаниями для переливания лейкоцитной массы служат иммунодепрессивные состояния при гнойно-септических процессах, дефицит лейкоцитов при миелотоксической депрессии кроветворения.
Литература
"Неотложная медицинская помощь", под ред. Дж.Э. Тинтиналли, Р. Кроума, Э. Руиза, Перевод с английского д-ра мед. наук В.И. Кандрора, М.В. Неверовой, А.В. Сучкова, А.В. Низового; под ред. В.Т. Ивашкина, П.Г. Брюсова; Москва "Медицина" 2001
Интенсивная терапия. Реанимация. Первая помощь: Учебное пособие / Под ред. В.Д. Малышева. – М.: Медицина. – 2000. – 464 с.: ил. – Учеб. лит. Для слушателей системы последипломного образования.
Спектр промышленных продуцентов и выпускаемых полисахаридов
весьма разнообразен (табл. 2.3). Ведущими странами – производителями
полисахаридов являются: США, Франция (ксантан, курдлан), Россия (дек-
стран), Япония (пуллан, курдлан).
Технология получения декстранов
Продуцентами декстранов являются штаммы Leuconostac mesente-
roides, растущие на средах с высоким содержанием сахарозы (10–30 %),
дестраном-«затравкой», дрожжевым экстрактом и минеральными солями.
В зависимости от состава минеральных солей и той или иной природы
«затравки» синтезируются высокомолекулярные (60–80 тыс.) линейные
или имеющие низкую молекулярную массу (20–30 тыс.) разветвленные
декстраны. Последние обладают наибольшей биологической активностью.
Из декстранов выпускают плазмозаменители (клинический декстран, по-
лиглюкин, плазмодекс, хемодекс и др.).
Типичный пример ферментации – глубинная периодическая культура,
реализуемая на первом этапе с целью образования биомассы продуцента
при избытке сахаров и рН 6.5–8.0. Синтез декстрансахаразы, ведущий к
образованию гликанов, наиболее интенсивен при рН около 7.0. Помимо
ионов магния синтез декстранов стимулируется при замене сахарозы ме-
лассой. Бактерии расщепляют сахарозу с образованием глюкозы и фрук-
тозы. Последняя сбраживается по гетероферментному пути с образовани-
ем молочной и уксусной кислот, маннита и углекислоты. Глюкоза быстро
полимеризуется в декстран. Процесс завершается через 24 ч. Выделение
декстрана из культуры проводят метанолом, для последующей очистки –
многократно растворяют в воде, переосаждают метанолом и фракциони-
руют. Декстрансахараза является экзоферментом, и ее концентрация в
культуральной среде значительна. Поэтому возможен процесс получения
полисахарида на основе растворимого фермента. Культуральная жидкость
с декстрансахаразой при рН около 5.0 и 15°С способна около месяца про-
являть высокую ферментативную активность. Реализован процесс на ос-
нове культуральной среды с ферментом, содержащей сахарозу и декстран-
«затравку», – процесс полимеризации завершается в течении 8 ч. Этот
способ значительно упрощает процедуру ферментации и стадию выделе-
ния и очистки декстрана и позволяет в контролируемых условиях полу-
чать продукт заданной молекулярной массы. Перспективы имеет также
процесс на основе иммобилизованной декстрансахаразы. В середине 90-х
гг. начат выпуск коньюгатов модифицированного декстрана с ферментом
стрептокиназой. Препарат представляет собой пролонгированную декст-
раном форму стрептокиназы.
Изобретение относится к способу получения флуоресцентных производных декстранов, предназначенных для изучения транспорта биологически активных веществ через клеточные мембраны и изучения механизмов действия лекарственных препаратов на клеточном и субклеточном уровнях. Способ получения включает проведение реакции флуоресцентного красителя с активированным окисленным декстраном с последующей очисткой конечного продукта от примесей путем ультрафильтрации. В качестве флуоресцентного красителя используют флуоресцеин, в качестве активирующего реагента - 1,1'-карбонилдиимидазол и активацию окисленного декстрана производят путем добавления 1,1'-карбонилдиимидазола в реакционную смесь окисленного декстрана с флуоресцеином. 4 з.п. ф-лы.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ
Изобретение относится к экспериментальной медицине и биологии, в частности к способу получения меченых полисахаридов, предназначенных для изучения транспорта биологически активных веществ через клеточные мембраны и изучения механизмов действия лекарственных препаратов на клеточном и субклеточном уровнях.
В экспериментальной медицине широко используются флуоресцентные производные полисахаридов, в частности декстрана, для изучения транспорта биологически активных веществ через клеточные мембраны (1). Особый интерес для фармакологии представляют окисленные декстраны, так как они обладают высокой биосовместимостью, иммуномодулирующей активностью и могут использоваться в качестве перспективной матрицы для иммобилизации биологически активных веществ с целью их адресной доставки в различные клетки-мишени (2). Окисленные декстраны представляют собой производные декстрана, полученные путем его химического или радиационного окисления и содержащие карбонильные группы. С помощью окисленных декстранов получены перспективные лекарственные композиции (конъюгаты) для лечения туберкулеза (3), системных микозов (4) и вирусных заболеваний (5). Однако механизм действия окисленных декстранов до настоящего времени изучен недостаточно, так как отсутствуют способы получения их флуоресцентных производных. Основная проблема при создании указанных производных состоит в сохранении карбонильных групп, образующихся при окислении декстранов и обусловливающих их специфические биологические свойства.
Известен способ получения флуоресцентных производных полисахаридов, в частности декстрана, включающий получение G-, R- или F-производных декстрана; проведение реакции взаимодействия G-производного декстрана с флуоресцентным красителем, содержащим R-функциональную группу, или реакции R-производного декстрана с флуоресцентным красителем, содержащим G-функциональную группу, или реакции F-производного декстрана с флуоресцентным красителем, содержащим G-функциональную группу, и со связующим реагентом, например карбодиимидом; очистку флуоресцентного производного декстрана от примесей (свободного красителя и свободного декстрана) путем фильтрации и последующего хроматографического разделения, где R - реакционно-способные группы, например сукцинимидные группы, карбоксильные, изотиоцианатные, галогенацетамидные, малеимидные, азидные, альдегидо- и кетогруппы или сульфгидрильные группы, G и F - комплементарные функциональные группы, например карбоксильные, альдегидные, кето-, амино- или сульфгидрильные группы (6). Недостатком известного способа является его непригодность для получения флуоресцентных производных окисленных декстранов, т.к. это может привести к полной потере карбонильных групп, обусловливающих специфические биологические свойства окисленных декстранов.
Наиболее близким к заявленному является способ получения флуоресцентного производного декстрана, включающий активацию декстрана путем реакции с бромпропиламином, осаждение полученного аминопроизводного декстрана этанолом; очистку аминопроизводного декстрана диализом; проведение реакции аминопроизводного декстрана с 5-([4,6-дихлоротриазин-2-ил]амино)-флуоресцеином путем конденсации в буферном растворе; отделение полученного флуоресцентного производного декстрана от свободного 5-([4,6-дихлоротриазин-2-ил]амино)-флуоресцеина ультрафильтрацией, в частности, диализом; очистку флуоресцентного аминопроизводного декстрана путем хроматографического разделения (7).
Недостатком способа-прототипа является его непригодность для получения флуоресцентного производного окисленного декстрана. Это обусловлено тем, что активация окисленного декстрана бромпропиламином может привести к полной потере карбонильной емкости (карбонильных групп) окисленного декстрана, что также приведет к изменению его биологических свойств. Используемый в способе флуоресцентный краситель - 5-([4,6-дихлоротриазин-2-ил]амино)-флуоресцеин - также может реагировать с карбоксильными группами окисленного декстрана и изменять его биологические свойства. Кроме того, 5-([4,6-дихлоротриазин-2-ил]амино)-флуоресцеин обладает токсичностью, не является коммерческим продуктом, что требует дополнительных затрат на его синтез.
Задачей, на решение которой направлено изобретение, является получение флуоресцентного производного окисленного декстрана с сохранением в его составе карбонильных групп, обусловливающих его специфические биологические свойства, упрощение способа.
Поставленная техническая задача достигается тем, что в качестве производного декстрана используют окисленный декстран, в качестве флуоресцентного красителя используют флуоресцеин, в качестве активирующего реагента - 1,1'-карбонилдиимидазол, активацию окисленного декстрана производят путем добавления 1,1'-карбонилдиимидазола в реакционную смесь окисленного декстрана с флуоресцеином; при этом используют окисленный декстран с молекулярной массой 35-65 кДа, предварительно растворенный в боратном буферном растворе с рН 9,2-11,0; соотношение компонентов реакционной смеси флуоресцеин - окисленный декстран составляет 1:(110-120) в пересчете на массу сухого вещества; соотношение компонентов 1,1'-карбонилдиимидазол - окисленный декстран составляет 1:(21,0-21,5) в пересчете на массу сухого вещества.
Описание сущности изобретения
Способ получения флуоресцентного производного декстрана включает проведение реакции окисленного декстрана с флуоресцеином, для активации окисленного декстрана в ходе проведения указанной реакции в реакционную смесь добавляют 1,1'-карбонилдиимидазол, очистку целевого продукта от примесей осуществляют методом ультрафильтрации.
Для осуществления заявленного способа сухой окисленный декстран с молекулярной массой 35-65 кДа предварительно растворяют в боратном буферном растворе с рН 9,2-11,0 до концентрации 10%.
Флуоресцеин смешивают с полученным раствором окисленного декстрана в весовом соотношении 1:(110-120) из расчета на сухую массу веществ. Для запуска реакции в реакционную смесь добавляют 1,1'-карбонилдиимидазол в качестве активирующего реагента в весовом соотношении с декстраном 1:(21,0-21,5) в пересчете на массу сухого вещества. 1,1'-карбонилдиимидазол способствует взаимодействию окисленного декстрана с флуоресцеином путем активации гидроксильных групп окисленного декстрана. Реакцию проводят при слабом перемешивании при комнатной температуре в течение 18-24 часов.
Затем реакционную смесь очищают от низкомолекулярных компонентов реакционной смеси (непрореагировавших флуоресцеина и 1,1'-карбонилдиимидазола, а также компонентов боратного буфера) методом ультрафильтрации в режиме диафильтрации с использованием в качестве растворителя воды на мембранах, позволяющих отсекать низкомолекулярные соединения с М.м. 10 кДа или 5 кДа. В результате получают очищенный раствор флуоресцентного производного окисленного декстрана. Примеси не содержат свободного окисленного декстрана, поскольку 1,1'-карбонилдиимидазол реагирует с гидроксильными группами окисленного декстрана, которых не менее 5 на каждое глюкопиранозное кольцо, при этом флуоресцеин и 1,1'-карбонилдиимидазол берутся в избытке в соответствии с указанными выше пропорциями.
Определяющим существенным отличием заявляемого способа от способа-прототипа является то, что для обеспечения взаимодействия с флуоресцеином активацию окисленного декстрана проводят с помощью 1,1'-карбонилдиимидазола, который не вступает в реакцию с карбонильными группами окисленного декстрана, отвечающими за его биологические свойства. Используемый в заявленном способе флуоресцентный краситель флуоресцеин не обладает нежелательными побочными эффектами, является коммерческим продуктом, что в отличие от прототипа не требует дополнительных затрат на его синтез. Кроме того, заявленный способ содержит меньшее количество операций по очистке конечного продукта от примесей (не требуется хроматографического разделения). Все вышеуказанное делает его более простым в исполнении.
Примеры конкретного выполнения
Пример 1.
Сухой окисленный декстран с молекулярной массой 65 кДа растворяют в боратном буферном растворе с рН 9,2 до концентрации 10%. В 200 мл полученного 10%-ного раствора окисленного декстрана вносят навеску флуоресцеина массой 0,18 г и перемешивают смесь до полного растворения флуоресцеина (соотношение флуоресцеин - окисленный декстран - 1:110 в пересчете на массу сухого вещества). В полученный раствор вносят навеску 1,1'-карбонилдиимидазола массой 0,930 г (соотношение 1,1'-карбонилдиимидазол - окисленный декстран равно 1:21,5 в пересчете на массу сухого вещества), реакционную смесь перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 20 часов при слабом перемешивании. Затем проводят диафильтрацию на мембранном модуле Vivaflow 200 с отсекающей М.м. 10 кДа (активная мембранная поверхность 200 см2), используя в качестве замещающего раствора 4 л дистиллированной воды. Получают раствор флуоресцентного производного окисленного декстрана. Чистоту конечного продукта контролируют методом капиллярного электрофореза. Выход целевого продукта составляет 92% от расчетного значения.
Пример 2.
Сухой окисленный декстран с молекулярной массой 35 кДа растворяют в боратном буферном растворе с рН 11,0 до концентрации 10%. В 200 мл полученного 10%-ного раствора окисленного декстрана вносят навеску флуоресцеина массой 0,167 г (соотношение флуоресцеин - окисленный декстран - 1:120 в пересчете на сухое вещество) и перемешивают смесь до полного растворения флуоресцеина. В полученный раствор вносят навеску 1,1'-карбонилдиимидазола массой 0,952 г (соотношение 1,1'-карбонилдиимидазол -окисленный декстран равно 1:21,0 в пересчете на массу сухого вещества), реакционную смесь перемешивают 10 минут и оставляют при комнатной температуре на 18 часов при слабом перемешивании. Затем проводят диафильтрацию на мембранном модуле Vivaflow 200 с отсекающей М.м. 5 кДа (активная мембранная поверхность 200 см2 ), используя в качестве замещающего раствора 3,5 л дистиллированной воды. Получают раствор флуоресцентного производного окисленного декстрана. Чистоту конечного продукта контролируют методом капиллярного электрофореза. Выход целевого продукта составляет 94% от расчетного значения.
Пример 3.
Сухой окисленный декстран с молекулярной массой 60 кДа растворяют в боратном буферном растворе с рН 10,0 до концентрации 10%. В 200 мл 10%-ного раствора окисленного декстрана вносят навеску флуоресцеина массой 0,174 г (соотношение флуоресцеин - окисленный декстран - 1:114,9 в пересчете на сухое вещество) и перемешивают смесь до полного растворения флуоресцеина. В полученный раствор вносят навеску 1,1'- карбонилдиимидазола массой 0,937 г (соотношение 1,1'- карбонилдиимидазол - окисленный декстран равно 1:21,3 в пересчете на массу сухого вещества), реакционную смесь перемешивают 10 минут и оставляют при комнатной температуре на 24 часа при слабом перемешивании. Затем проводят диафильтрацию на мембранном модуле Vivaflow 200 с отсекающей М.м. 5 кДа (активная мембранная поверхность 200 см2), используя в качестве замещающего раствора 3,5 л дистиллированной воды. Получают раствор флуоресцентного производного окисленного декстрана. Чистоту конечного продукта контролируют методом капиллярного электрофореза. Выход целевого продукта составляет 93% от расчетного значения.
Источники информации
1. Shimizu N, Kawazoe Y. - A new method for permeabilization of the plasma membrane of cultured mammalian cells. III. Intemalization of fluorescent dextrans into cultured mammalian cells by vortex-stirring in the presence of high molecular weight polyacrylic acid. - Biol Pharm Bull. 1996 Aug; 19(8); 1023-5.
2. Shkurupii V.A., Arkhipov S.A., Troitskii A.V., Luzgina N.G., Zaikovskaja M.V., Gulyaeva E.P., Bystrova T.N., Ufimtseva E.G., Il'in D.A., Akhramenko E.S. In vitro effect of oxidizeg dextrans of peritoneal cells // Bulletin of Experimental Biology and Medicine, Supplement 1. - 2008. - P.120-122.
3. Shkurupii V.A., Archipov S.A., Tkachev V.O., Troitskii A.V, Luzgina N.G., Zaikovskaya M.V.,. Gulyaeva E.P, Bystrova T.N., Ufimtseva E.G. In Vitro Effects of Molecular Nanosomal Hybrid Compositions with Oxidized Dextrans, Conjugated with Isonicotinic Acid Hydrazine on Peritoneal Macrophages // Bulletin of Experimental Biology and Medicine - 2008 - Vol.146. - No.5 - P.627-629.
4. Шкурупий В.А., Селятицкая В.Г., Цырендоржиев Д.Д., Пальчикова Н.А., Курилин В.В., Травин М.А., Надев А.П., Троицкий А.В. Эффекты модифицированного амфотерицина В при системном кандидозе в эксперименте. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007 - Т.143. - № 4 - С.367-370.
5. Шкурупий В.А., Шаркова Т.В., Потапова О.В., Шестопалов A.M. Регенераторно-пластические процессы в печени млекопитающих при гриппе птиц A/H5N1 и его профилактике модифицированным декстраном. // IV Всероссийская научно-практическая конференция «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов». - Новосибирск, 2009. - С.289.
6. Патент США № 5877310 «Glycoconjugated fluorescent labeling reagents», опубликован 1997.04.25, МПК С07Н 17/00 (20060101); С09В 23/02 (20060101); С09В 23/00 (20060101); C12Q 1/68 (20060101); С08В 37/02 (20060101); С08В 37/00 (20060101); С08 В 37/16 (20060101); С07Н 17/02 (20060101); G01N 33/533(20060101); G01N 33/58 (20060101); С07Н 021/02 (); С07Н 017/08 (); C07H 021/04(); G01N 033/53 ().
7. Prigent-Richard S., Cansell M., Vassy J., Viron A., Puvion E., Jozefonvicz J., Letourneur D. - Fluorescent and radiolabeling of polysaccharides: Binding and internalization experiments on vascular cells. - J Biomed Mater Res, 1998, 40, 275-281.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения флуоресцентных производных декстранов, включающий проведение реакции флуоресцентного красителя с активированным производным декстрана с последующей очисткой конечного продукта от примесей путем ультрафильтрации, отличающийся тем, что в качестве производного декстрана используют окисленный декстран, в качестве флуоресцентного красителя используют флуоресцеин, в качестве активирующего реагента - 1,1'-карбонилдиимидазол, активацию окисленного декстрана производят путем добавления 1,1'-карбонилдиимидазола в реакционную смесь окисленного декстрана с флуоресцеином.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют окисленный декстран с молекулярной массой 35-65 кДа.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что окисленный декстран предварительно растворяют в боратном буферном растворе с рН 9,2-11,0 до концентрации 10%.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что соотношение компонентов реакционной смеси флуоресцеин - окисленный декстран составляет 1:(110-120) в пересчете на массу сухого вещества.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что соотношение компонентов 1,1'-карбонилдиимидазол - окисленный декстран составляет 1:(21,0-21,5) в пересчете на массу сухого вещества.
Применение декстрана в медицине
ИНСТРУКЦИЯ по медицинскому применению препарата ДЕКСТРАН 40 раствор для инфузий
Регистрационный номер: Торговое название препарата: Декстран 40. Международное непатентованное название: декстран, средняя молекулярная масса 35000-45000. Лекарственные формы: раствор для инфузий 10 % . Состав: Декстран 40 со средней молекулярной массой 35000-45000 - 100 г, натрия хлорида 9 г, воды для инъекций до 1 л. Описание: бесцветная или слегка желтоватая прозрачная жидкость. Фармакотерапевтическая группа: плазмозамещающее средство. Код АТХ: В05АА05. Фармакологическе свойства Фармакодинамика: плазмозамещающе средство, повышает суспензионную устойчивость крови, уменьшает ее вязкость, восстанавливает кровоток в мелких капиллярах, нормализует артериальное и венозное кровообращение, предотвращает и снижает агрегацию форменных элементов крови, оказывает дезинтоксикационное действие. По осмотическому механизму стимулирует диурез (фильтруется в клубочках, создает в первичной моче высокое онкотическое давление и препятствует реабсорбции воды в канальцах), чем способствует (и ускоряет) выведению ядов, токсинов, деградационных продуктов обмена. Выраженный волемический эффект положительно сказывается на гемодинамике и одновременно сопровождается вымыванием продуктов метаболизма из тканей, что вместе с увеличением диуреза обеспечивает ускоренную детоксикацию организма. Вызывает быстрое и кратковременное увеличение объема крови, вследствие чего увеличивается возврат венозной крови к сердцу. При сосудистой недостаточности повышает артериальное давление, минутный объем крови и центральное венозное давление. Обладает средней мол. массой (40 тыс. Da). При быстром введении объем плазмы может увеличиться в 2 раза по сравнению с объемом введенного препарата, т.к. каждый грамм полимера декстрозы с мол. массой 35-45 тыс. Da способствует перераспределению 20-25 мл жидкости из тканей в кровяное русло. Апирогенен, нетоксичен. Предотвращает или уменьшает агрегацию эритроцитов, что улучшает микроциркуляцию. Снижает адгезивность тромбоцитов, предотвращает образование тромбов после операции и травм, повышает их растворимость (вследствие изменения структуры фибрина). При применении в дозе до 15 мл/кг не вызывает заметного изменения времени кровотечения.
Фармакокинетика: период полувыведения - 6 ч. Выведение - почками, за 6 ч выводится 60 %, а за 24 ч – 70 %, 30 % поступает в ретикуло-эндотелиальную, систему, печень, где расщепляется ферментом кислой альфа-глюкозидазой до глюкозы, однако не является источником углеводного питания.
Показания. Для улучшения капиллярного кровотока и восполнения объема циркулирующей крови: паралитическая кишечная непроходимость, жировая эмболия; травматический, ожоговый, геморрагический, послеоперационный и токсический шок (профилактика и лечение). Замещение объема плазмы при кровопотере в педиатрии. Для улучшения артериального и венозного кровообращения (профилактика и лечение): тромбоз, тромбофлебит, облитерирующий эндартериит, болезнь Рейно, угроза развития гангрены, острая стадия инсульта. Для дезинтоксикации: перитонит, панкреатит, язвенно-некротический энтероколит, пищевые токсикоинфекции, обширные гнойно-некротические процессы мягких тканей, краш-синдром, синдром «включения». Для гемодилюции в предоперационном периоде. Проведение лечебного плазмафереза с целью замещения удаляемого объема плазмы. Профилактика тромбообразования на трансплантатах (клапаны сердца, сосудистые трансплантаты); для добавления к перфузионному раствору в аппарате искусственного кровообращения при операциях на открытом сердце. Нарушения микроциркуляции: травматическая или идиопатическая потеря слуха. Заболевания сетчатки и зрительного нерва (осложненная миопатия высокой степени, дистрофия сетчатой оболочки, сосудистая (венозная) патология сетчатки, начальная атрофия), воспалительные заболевания роговицы и сосудистой оболочки глаза.
Противопоказания. Гиперчувствительность, кровоточивость, тромбоцитопения; хроническая почечная недостаточность (анурия), декомпенсированная хроническая сердечная недостаточность (опасность развития отека легких); электрофорез противопоказан при мацерации кожи век, обильном слизисто-гнойном отделяемом.Режим дозирования. Индивидуальный, определяется состоянием пациента, величиной артериального давления, частотой сердечных сокращений, показателями гематокрита. Внутривенно струйно, струйно-капельно и капельно. Дозы и скорость введения препарата следует выбирать индивидуально, в соответствии с показаниями и состоянием больного. При применении препарата обязательно проведение биопробы: после медленного введения первых 5 капель препарата прекращают переливание на 3 мин, затем вводят еще 30 кап. и снова прекращают вливание на 3 мин. При отсутствии реакции продолжается введение препарата. Результаты биопробы обязательно регистрируются в истории болезни. 1. При нарушении капиллярного кровотока (различные формы шока) вводят внутривенно капельно или струйно-капельно, в дозе от 0,5 до 1,5 л, до стабилизации гемодинамических показателей на жизнеобеспечивающем уровне. При необходимости количество препарата может быть увеличено до 2 л. У детей при различных формах шока вводят из расчета 5-10 мл/кг, доза может быть увеличена при необходимости до 15 мл/кг. Не рекомендуется снижать величину гематокрита ниже 25 %.
2. При сердечно-сосудистых и пластических операциях вводят внутривенно капельно, непосредственно перед хирургическим вмешательством, в течение 30-60 мин взрослым и детям в дозе 10 мл/кг, во время операции взрослым – 500 мл, детям – по 15 мл/кг. После операции препарат вводят внутривенно капельно (в течение 60 мин) в течение 5-6 дней из расчета: взрослым – 10 мл/кг однократно, детям до 2-3 лет – 10 мл/кг 1 раз в сутки, детям до 8 лет – по 7-10 мл/кг 1-2 раза в сутки, детям до 13 лет – по 5-7 мл/кг 1-2 раза в сутки. Для детей старше 14 лет дозы те же, что и для взрослых. 3. При операциях в условиях искусственного кровообращения препарат добавляют к крови из расчета 10-20 мл/кг массы тела больного для заполнения насоса оксигенатора. Концентрация декстрана в перфузионном растворе не должна превышать 3 %. В послеоперационном периоде дозы препарата такие же, как при нарушении капиллярного кровотока. 4. С целью дезинтоксикации вводят внутривенно капельно в разовой дозе от 500 до 1250 мл (у детей 5-10 мл/кг) в течение 60-90 мин. При необходимости можно в первые сутки перелить еще 500 мл препарата (у детей введение препарата в первые сутки может быть повторено в тех же дозах). В последующие дни препарат вводят капельно, взрослым – в суточной дозе 500 мл, детям – из расчета 5-10 мл/кг. Совместно целесообразно вводить кристаллоидные растворы (Рингера и Рингера-ацетата и др.) в таком количестве, чтобы нормализовать водно-электролитный баланс (особенно важно при лечении обезвоженных больных и после хирургических операций), препарат, как правило, вызывает увеличение диуреза (уменьшение диуреза указывает на обезвоживание организма больного). 5. В офтальмологической практике применяют путем электрофореза, который проводят общепринятым способом. Расход препарата на одну процедуру составляет 10 мл. Процедуру проводят 1 раз в день, вводят как с положительного, так и отрицательного полюса. Плотность тока - до 1,5 мА/кв.см. Продолжительность процедуры - 15-20 мин. Курс лечения состоит из 5-10 процедур.
Побочные эффекты. Аллергические реакции (кожная сыпь, анафилактоидные реакции – снижение артериального давления, коллапс, олигурия), жар, озноб, лихорадка, тошнота. Может провоцировать кровоточивость, развитие острой почечной недостаточности.
Передозировка. В случае избыточного введения раствора препарата внимательно оценивают состояние больного и назначают соответствующее симптоматическое лечение.
Особые указания. Совместно с препаратом целесообразно вводить кристаллоидные растворы (0,9 % раствор натрия хлорида, 5 % раствор декстрозы) в таком количестве, чтобы восполнить и поддержать жидкостный и электронный баланс. Это особенно важно при лечении обезвоженных больных и после тяжелых хирургических операций. При одновременном применении с антикоагулянтами необходимо снижение их дозы. Вызывает увеличение диуреза (если наблюдается снижение диуреза с выделением вязкой сиропообразной мочи, то это может указывать на обезвоживание). В этом случае необходимо ввести внутривенно коллоидные растворы для восполнения и поддержания вводно-электролитного баланса. В случае возникновения олигурии необходимо ввести солевые растворы и фуросемид. У больных со сниженной фильтрационный способностью почек необходимо ограничить введение натрия хлорида. Декстраны способны обволакивать поверхность эритроцитов, препятствуя определению группы крови, поэтому необходимо использовать отмытые эритроциты.
Форма выпуска. Раствор для инфузий 100 мг/мл по 250, 500 мл в бутылки стеклянные для инфузионных растворов вместимостью 300 и 550 мл импортного производства; или по 200 и 400 мл в бутылки стеклянные для крови или кровезаменителей вместимостью 250 и 450 мл. Каждую бутылку упаковывают в индивидуальную картонную пачку с инструкцией по применению. 10 пачек с емкостями укладывают в коробку из картона. Для стационаров: по 10 бутылок укладывают в ящик из картона гофрированного с 10 инструкциями по применению. Условия хранения. В сухом, недоступном для детей месте, при температуре от 10 до 25 о С. Допускается замораживание при транспортировании. Срок годности: 2 года. Не применять по истечении срока годности, указанного на упаковке. Условия отпуска из аптек: по рецепту.
Заключение
ДЕКСТРАНЫ
(С6Н10О5)n,
группа бактериальных полисахаридов,
состоящих из остатков -D-глюкопиранозы.
Молекулы
декстранов - разветвленные цепи (см.
ф-лу), линейная часть к-рых содержит гл.
обр. 1 :
6-связи и небольшое кол-во 1 :
3-связей (в нек-рых редко встречающихся
декстранах обнаружены
чередующиеся 1 : 6- и 1 :3-связи). Разветвления в молекуле декстрана образуются с помощью 1 : 2-, 1 : 3- или 1 :4-связей. В индивидуaльном декстране обычно имеются один или два типа связей ветвления. Боковые ветви молекулы состоят обычно из одного или двух остатков глюкозы, реже встречаются более длинные боковые цепи. Мол. м. декстранов 107-108: []D25 индивидуальных декстранов варьирует от + 208 до + 233 ° (формамид) и от + 203 до + 232 ° (1 н. р-р КОН). Св-ва полисахарида зависят от его структуры и мол. массы. Известны декстраны, к-рые хорошо раств. в воде, формамиде, ДМФА и ДМСО, нек-рые раств. только в р-рах щелочи. В ИК спектре декстраны дают полосы поглощения в области 917, 840 и 768 см1, характерные для 1 :6-гликозидных связей. Декстраны продуцируются разными видами бактерий семейства стрептококковых Streptococcaceae. Наиб. изучены декстраны, продуцируемые видами Leuconostoc mesenteroides и Leuconostoc dextranicum. Биосинтез декстранов осуществляется путем расщепления сахарозы с послед. переносом остатка глюкозы на акцептор, к-рым м. б. сахароза или растущая цепь декстрана. Р-ция катализируется ферментом декстрансахаразой. Осуществлен синтез простейшего линейного -1 : 6-глюкана полимеризацией 1,6-ангидро-2,3,4-три-О-бензил--D-глюкопиранозы в присут. кислых катализаторов с послед. удалением защитных групп. В пром-сти декстраны получают выращиванием бактерий-продуцентов на среде, содержащей сахарозу, с послед. осаждением декстранов орг. р-рителем. Декстраны с заданными св-вами м. б. получены с помощью очищенных препаратов декстрансахаразы. Количеств. определение декстранов осуществляют по глюкозе, образующейся при его гидролизе. Частично гидролизованные, т. н. клинические, декстраны с мол. м. 30-80 тыс. (содержат не менее 95% 1 :6-связей) используют для приготовления плазмозаменителей противошокового и гемодинамич. действия. Декстраны, сшитые поперечными связями эпихлоргидрином (т. н. с е ф а д е к с ы), и их производные - сорбенты в гель-хроматографии, ионообменной и гидрофобной хроматографии и электрофорезе. === Исп. литература для статьи «ДЕКСТРАНЫ»: Преображенская М.Е., Декстраны и декстраназы. Успехи биологической химии, т. 16, М., 1975, с. 214-35; Dextran bibliography, ed. by A. Jeanes, Wash., 1978; WalkerG.J., "Internet Rev. of Biochem.", Biochemistry of Carbohydrate, v. 16, Balt., 1978, p. 75-126. M.E. Преображенская.