7.2. Окислительное декарбоксилирование пирувата
В аэробных условиях превращение пирувата идет на пируватдегидроге-назном мультиферментном комплексе, работу которого обеспечивают три фермента: пируватдегидрогеназа, дигидролипоил-ацетилтрансфераза и дигидролипоилдегидрогеназа, объединенные в частицы диаметром около 45 нм. Комплекс включает пять коферментов или простетических групп (тиаминпирофосфат, липоевая кислота, кофермент А, флавинадениндинук-леотид и никотинамидадениндинуклеотид). Из них только липоевая кисло-та образуется в организме животных из обычных метаболитов, тогда как тиамин (в ТРР), рибофлавин (в FAD), пантотеновая кислота (в коферменте А) и никотинамид (в NAD+) должны поступать в организм животных в виде витаминов.
Не нуждающийся в кислороде гликолиз идет в цитозоле клетки, но основ-ные аэробные биоэнергетические процессы идут в матриксе митохондрий, отделенном от цитозоля двумя мембранами. Через внешнюю мембрану митохондрий легко проходят все вещества с молекулярной массой до 10000 Да, а для транспорта через внутреннюю мембрану существуют транспортные системы, одна из которых предназначена для переноса моле-кул пировиноградной кислоты.
Окислительное декарбоксилирование пирувата начинается с присоедине-ния его к тиаминпирофосфату так, как это было представлено выше для процесса спиртового брожения, но образовавшаяся после декарбоксилиро-вания пирувата 1‑гидроксиэтильная группа не отщепляется в виде альде-гида, а переносится на один из атомов серы дитиоланового цикла остатка липоевой кислоты (простетическая группа) в виде ацетата и атома водо-рода. Остаток липоевой кислоты присоединен к ферменту через амино-группу лизинового фрагмента белковой молекулы:
Декарбоксилированный тиамином остаток пировиноградной кислоты переносится на дитиолановый фрагмент по схеме:
Теперь ацетилированный фрагмент дигидролипоил-ацетилтрансферазы ма-ятниковым движением отходит от тиаминпирофосфатного участка муль-тиферментного комплекса и отдает ацетильный остаток коферменту А:
Движение остатка дигидролипоевой кислоты после переноса ацетильной группы на кофермент А завершается у дегидрогеназного участка мульти-ферментного комплекса, где атомы водорода двух сульфгидрильных групп отходят к флавинадениндинуклеотиду и далее к никотинамидаденинди-нуклеотиду:
,
а образовавшийся в результате дегидрирования дитиолановый цикл воз-вращается к тиаминпирофосфатному участку для того, чтобы снова при-нять 1-гидроксиэтильный остаток в виде ацетильной группы и атома водорода.
Процесс превращения пировиноградной кислоты в ацетилкофермент А необратим. При введении в обмен веществ меченного по углероду уголь-ного ангидрида радиоактивная метка никогда не обнаруживается в пиро-виноградной кислоте.
7.3. Цикл Кребса
Последовательность превращений ацетильного остатка, образовавшегося после декарбоксилирования пирувата, была открыта в 1937 году немецким биохимиком Кребсом, эмигрировавшим в 1933 году в Великобританию. Чаще всего это многостадийное циклическое превращение называют по имени открывшего его ученого, но можно также встретить такие названия, как цикл лимонной кислоты или цикл трикарбоновых кислот. Открытие цикла Кребса было отмечено Нобелевской премией 1953 года. Кребс разделил ее с Липманном, открывшим аденозинтрифосфатный цикл.
В основу расшифровки биохимических превращений цикла Кребса легли наблюдения за обменными процессами в мышечных тканях. В них и рань-ше обнаруживали незначительные количества дикарбоновых кислот (ян-тарной, фумаровой, яблочной, щавелевоуксусной), а также трикарбоновых кислот (лимонной, цис-аконитовой, изолимонной). Добавки этих кислот к измельченной мышечной ткани вызывали заметное увеличение потребле-ния ими кислорода, а малоновая кислота останавливала течение аэробных обменных процессов, вызывая в клетках накопление лимонной, кетоглу-таровой и янтарной кислот. Кребс установил также, что инкубация мышеч-ных клеток с пировиноградной и щавелевоуксусной кислотой приводит к росту концентрации в них лимонной кислоты. Эти наблюдения легли в основу представлений о циклическом пути превращений, в ходе которого на начальном этапе из оксалоацетата и ацетилкофермента А образуется лимонная кислота, а конечным продуктом превращений цитрата является оксалоацетат, с которого этот процесс начинался.
На первой стадии цикла Кребса фермент цитратсинтаза катализирует обра-зование лимонной кислоты (анион цитрат) по схеме:
В учебниках по биохимии принято представлять и называть кислоты как анионы, акцентируя этим внимание на то, что в живых клетках поддер-живается слабо щелочная среда, но для лучшего понимания химизма про-цессов здесь и далее будут использоваться традиционные для химиков уравнения реакций. Суть представленной реакции состоит в том, что в тиоэфирах карбоновых кислот атомы водорода в -положении к карбо-нильной группе соответствуют по реакционной способности аналогичным атомам водорода в карбонильных соединениях. В соответствии с этим реакция образования лимонной кислоты подобна реакции альдольной конденсации. Первичным продуктом этой реакции является, конечно, цитроил-кофермент А, но скорость его гидролиза выше скорости образова-ния и поэтому обнаружить его в клетках не удается.
Далее лимонная кислота при катализе цис-аконитазой превращается в изо-лимонную кислоту в результате обратимого отщепления и присоединения молекулы воды с образованием в качестве промежуточного продукта цис-аконитовой кислоты:
Цис-аконитаза – это металлопротеин с атомом железа Fe2+ в активном центре. Превращение цис-аконитовой кислоты в изолимонную идет против правила Марковникова и, действительно, в равновесном состоянии кон-центрация лимонной кислоты примерно на порядок превышает концент-рацию изолимонной, но в дальнейшем превращении участвует только изолимонная кислота, а условия равновесия восполняют ее расход за счет лимонной кислоты.
При дегидрировании изолимонной кислоты образуется трикарбоновая кетокислота, которая сразу декарбоксилируется и превращается в кето-глутаровую кислоту:
Далее ферментная система, аналогичная пируватдегидрогеназному муль-тиферментному комплексу, превращает кетоглутаровую кислоту в сукцинил-кофермент А:
Тиоэфирная связь в этом соединении делает его макроэргическим, поэтому превращение сукцинилкофермента А в анион янтарной кислоты (сукцинат) идет с образованием другого макроэргического вещества, аналога адено-зинтрифосфата – гуанозинтрифосфата:
Янтарная кислота дегидрируется FAD-зависимым ферментом с образова-нием фумаровой кислоты, которая превращается в L-яблочную кислоту (анион малат) в результате гидратации фумаразой:
И, наконец, L-малат-дегидрогеназа переводит яблочную кислоту в оксало-ацетат, с реакции которого с ацетил-коферментом А начиналась эта цепоч-ка превращений:
Роль щавелевоуксусной кислоты в биохимии не ограничивается участием в цикле Кребса. Она может быть предшественником аспарагиновой кислоты и аспарагина (правда, она может быть также получена из этих амино-кислот). Для иных обменных процессов из цикла Кребса могут изыматься и другие его участники, например, кетоглутаровая кислота для образова-ния глютаминовой кислоты и глютамина. Кроме того, щавелевоуксусная кислота – это исходный продукт для образования глюкозы при недостатке ее в пище. Не исключены также просто сбои в системе транспорта и пре-вращения участвующих в цикле Кребса веществ, которые приводят к потере оксалоацетата. Поэтому должен существовать автономный мех-анизм образования оксалоацетата. Этот биохимический процесс относится к анаболическим, но он является неотъемлемой частью цикла Кребса и поэтому есть смысл рассмотреть его в этом разделе.
Процессы, в которых образуются промежуточные продукты многостадий-ных биохимических превращений в общем случае называют анаплерозом. Исходным продуктом для образования оксалоацетата является пируват, который карбоксилируется бикарбонатным анионом с участием аденозин-трифосфата в каталитическом центре соответствующей карбоксилазы. По-ложительным эффектором этого фермента служит ацетил-кофермент А, то есть при отсутствии в клетках свободного ацетил-кофермента А биосинтез оксалоацетата из пирувата не идет. Механизм кабоксилирования биотин-зависимыми ферментами рассматривался выше.
В данном случае присоединенный на длинной цепочке гетероциклический структурный элемент, несущий карбоксилатную группу, перемещается в другой участок каталитического центра и там отдает ее пирувату с образованием оксалоацетата:
