микробиология / стоматМ2 / rus 2_13

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА № 2.13

Тема: Возбудители вирусных гепатитов И ВИЧ_инфекции. Микробиологическая диагностика гепатитов А и В. Серодиагностика СПИДа Актуальность темы. Вирусные гепатиты представляют собой группу, которая включает несколько самостоятельных нозологических форм. Гепатит А распространяется фекально-оральным путем и вызывает эпидемии. Вирус гепатита В (HBV), во многих случаях приводит к злокачественному перерождению печени, передается парентеральным путем и при стоматологических манипуляциях. В группу риска попадают как пациенты, так и врачи стоматологических клиник. Учитывая высокую устойчивость вируса, следует придерживаться необходимых мер асептики и антисептики при хирургических вмешательствах, переливании крови и других медицинских манипуляциях. Существуют также вирусы: HCV и HGV , они передаются как HBV, часто переходят в хроническую форму, вызывают карциному печени; HEV передается фекально-оральным путем, вызывает тяжелые формы гепатита у беременных. В самостоятельную нозологическую форму выделено гепатит, связанный с вирусом Дельта. Этот дефектный вирус способен осложнять течение гепатита В и вызвать цирроз печени. СПИД - смертельно опасное заболевание. Основным фактором широкого распространения вируса является переливание крови и другие медицинские манипуляции, связанные с нарушением целостности кожи и слизистых оболочек. Созданы международные и национальные программы противодействия распространению СПИДа, создаются профилактические и лечебные препараты. В стоматологии важен контроль за стерилизацией инструмента и меры индивидуальной защиты.. Цель: уметь различать типы вирусных гепатитов, выбирать методы их лабораторной диагностики, характеризовать препараты для их специфической профилактики. Учитывая особенности взаимодействия ретровирусов с организмом человека, и принимая во внимание эпидемиологическую и клиническую характеристики СПИДа, овладеть методами диагностики ВИЧ-инфекции. Конкретные цели - уметь: 1. Объяснять систематическое положение вирусов, которые являются возбудителями гепатита и ВИЧ инфекции у человека. 2. Обосновывать методы неспецифической профилактики вирусных гепатитов и СПИДа в связи с биологическими свойствами возбудителей. 3. Обосновывать выбор методов лабораторной диагностики гепатита А в разные периоды заболевания в связи с патогенезом. 4. Определять HBs-антиген в реакции двойной иммунной диффузии. Объяснять сроки и методы выявления других серологических маркеров. 5. Выбирать приемлемые методы микробиологической диагностики для гепатитов С, D, E и G. 6. Характеризовать состав, способ получения и механизм действия иммунобиологических препаратов для специфической профилактики вирусных гепатитов. 7. Описывать биологические и антигенные свойства ВИЧ, их связь с патогенезом заболевания. 8. Объяснять механизмы "невидимых" реакций иммунитета, которые используются для специфической диагностики ВИЧ - инфекции. Учитывать результаты ИФА и иммуноблоттинга. 9. Характеризовать современные подходы к профилактике и лечению СПИДа. Уровень знаний - умений: 1. Описывать различные типы взаимодействия вируса с клеткой. 2. Объяснять различия образование антител при первичном и вторичном иммунном ответе. 3. Объяснять сущность РДИД, ИФА, РИА, ИЭМ, способ учета результатов. 4. Трактовать механизм ПЦР. 5. Объяснять морфологические и функциональные свойства представителей клеточного звена иммунитета 6. Описывать механизм биосинтеза нуклеиновых кислот (РНК и ДНК)

7. Отличать оппортунистические инфекции от других форм инфекционного процесса. Для того чтобы вы могли уяснить, отвечает ли исходный уровень Ваших знаний-умений необходимому, предлагаем выполнить ряд заданий:

Задание 1. Вирус гепатита В способен интегрироваться в геном инфицированной клетки. Нередко это приводит к опухолевой трансформации клеток. Как называется такой тип взаимодействия вируса с клеткой? Задание 2. Какие антитела первыми образуются при контакте организма с возбудителем и могут быть показателем свежего заражения и острого течения болезни? а) IgA, б) IgM, в) IgG, г) IgD, д) IgE. Задание 3. Что общего у иммунобиологических препаратов, используемых в РИА, ИФА, ИЭМ для выявления вирусных антигенов ?. Задание 4. В серонегативный период для диагностики гепатита С используется ПЦР. Что именно обнаруживают в крови больного с ее помощью? а) IgM к антигенам вируса, б) IgG к антигенам вируса, в) антигены вируса,

г) неструктурные белки вируса, д) геномная РНК вируса.

Задание 5..Назовите основной компонент белок-синтезирующей системы? Задание 6..Дать характеристику популяции Т-лимфоцитов (перечислить известные типы Т-лимфоцитов, назвать их функции, поверхностные маркеры и рецепторы) Задание 7..Человек, больной СПИДом, становится жертвой оппортунистических инфекций. Какие свойства присущи возбудителям таких инфекций? Информацию для пополнения знаний-умений можно найти в следующих учебниках: 1. Гайдаш И.С., Флегонтова В.В. Медицинская вирология - Луганск, 2002 .- С. 78, 115-118. 2. Воробьев А.А. и др. Микробиология .- М.: Медицина, 1998 .- С. 55, 154-156, 180-181. 3. Медицинская Микробиология, вирусология и иммунология / Под ред. Л. Б. Борисова, А. М. Смирновой. М.: Медицина, 1994. С. 233-235. 3.Привес М.Г., Лысенко Н.И., Бушков В.И. Анатомия человека .- М.: Медицина .- 2001. 4.Березов Т.Т., Коровкин В.Ф. Биологическая химия .- М.: Медицина .- 1998. 5.Биохимия / Под ред. А. Николаева. М., 2004. с.118-138. 6.Афанасьев Ю.И., Юрина Н.А. Гистология, Цитология и эмбриологию .- М.: Медицина.-1999. 7.Медицинская Микробиология, вирусология и иммунология / Под ред. А. И. Коротяева: Санкт-Петербург: СпецЛит, 2000.с. 199-260. Теоретические вопросы, на основе которых возможно выполнение целевых видов деятельности: 1. Вирус гепатита А - систематическое положение, структура вириона, биологические и антигенные свойства. Устойчивость в окружающей среде, пути передачи. 2. Патогенез и клиника гепатита А. Иммунитет и профилактика. 3. Вирусологическая, иммунологическая и биохимическая диагностика гепатита А в разные периоды заболевания. 4. Биологические свойства и особенности построения вириона возбудителя гепатита В. Возможности культивирования, варианты взаимодействия вируса с клеткой. 5. Патогенез и клиника гепатита В. 6. Серологические маркеры вируса гепатита В, их выявление в разные периоды после заражения. 7. Вирус дельта, его свойства, особенности репродукции. Патогенез и клиника гепатита D, методы диагностики. 8. Возбудители гепатитов С, Е и G. Пути заражения, вероятность осложнений, методы диагностики и профилактика. 9..Систематика ВИЧ, морфология и биологические свойства. Устойчивость ВИЧ во внешней среде, изменчивость ВИЧ. 10. Взаимоддействие ВИЧ с клетками человеческого организма. 11. Имунопатологические изменения при ВИЧ-инфекции. 12. Клиника ВИЧ-инфекции: периоды, клинические симптомы 13.Диагностика ВИЧ-инфекции: в чем заключается сущность иммуно-ферментного анализа?

Литература для усвоения знаний-умений по данной теме: 1.Медицинская Микробиология, вирусология и иммунология / Под ред. Л. Б. Борисова, А. М. Смирновой. - М.: Медицина, 1994. - С. 364-371, 425-433, 498-513 2. Гайдаш И.С., Флегонтова В.В. Медицинская вирология - Луганск, 2002 .- С. 188-194, 296-298, 327 - 329, 341 - 344. 3. Пьяткiн К. Д., Кривошеин Ю. С. микробиология. - М.: Высшая школа, 1992. - С. 363-369, 388-391. 4. Воробьев А.А. и др. Микробиология .- М.: Медицина, 1998 .- С. 226 - 229, 244-248, 278 - 280. 5. Фролов А.В., Шевченко Л.Ф., Широбоков В.П. Практическая вирусология .- К.: Здоровье, 1989 .- С. 212-225. 6.Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии / Под ред. Л. Б. Борисова. - М.: Медицина, 1984. - С. 217, 224-229.

Содержание обучения должен обеспечить достижение целей обучения, чему способствует граф логической структуры темы: "Вирусы гепатитов. Диагностика вирусных гепатитов "(приложение 1). Ориентировочная основа действия при выполнении практической работы. 1. Изучить по таблице методы диагностики гепатита А в различные периоды заболевания. Занести в протокол имена методов и сроки их использования, указать используемые реактивы и оборудование. 2. Провести диагностику гепатита В путем выявления НВs-антигена (австралийский антиген) в сыворотке больного с помощью реакции двойной иммунной диффузии (РПИД). Для постановки реакции готовят слой агарового геля на стекле, специальным пробойником вырезают в агаре 7 лунок (1 в центре и 6 по кругу) на равном расстоянии друг от друга. В центральную лунку внести стандартную сыворотку, содержащую антитела к австралийскому антигену. В две диаметрально расположенные лунки внести австралийский антиген для постановки положительного контроля. Сыворотку, также как и антиген, получают от донора. В другие лунки вносят исследуемые сыворотки. Пластинку с Агаровым гелем помещают во влажную камеру и инкубируют примерно двое суток, после этого красят гель метиленовым синим. Рассмотреть готовы пластины с демонстрацией РПИД, отметить наличие линий преципитации там, где произошло соединение НВs-антигена с антителами к нему. Занести в протокол схематический рисунок постановки РПИД с пояснительными пометками. Сделать вывод о наличии антител к НВs-антигена в исследуемых сыворотках. По таблице ознакомиться с другими методами диагностики гепатита В. Отметить в протоколе названия методов и сроки их использования. 3. Составить сравнительную таблицу свойств вирусов, вызывающих гепатит у человека. 4. Усвоить принцип определения антител к вирусу СПИДа иммуно-ферментным методом Описать в протоколе реактивы, входящие в состав тест-системы, порядок постановки реакции ИФА; способ учета результатов Ознакомиться с использованием иммуноблоттинга для диагностик СПИДа. Отменен-тить в протоколе этапы исследования, реактивы и оборудование, используемых гооблагаемых на каждом этапе. 5. Сравнить иммунограммы здорового и больного СПИДом человека, указать в прото-коле различия в состоянии факторов неспецифической резистентности, Т и В сис-тем иммунитета.

После ознакомления с теоретическими вопросами и ходом проведения эксперимента вам предлагается выполнить следующие обучая задачи. 1. Среди учеников средней школы появились случаи заболевания, протекающего как вирусный гепатит: острое начало заболевания, короткий преджелтушного период, появление жовтяничности склер и кожных покровов, с началом желтушного периода самочувствие улучшалось. Установлено, что за 15-45 дней до появления признаков болезни все дети, которые заболели, пили из источника, вода в котором не обеззаражувалася. Медицинские манипуляции, связанные с повреждением кожных покровов в последние месяцы перед заболеванием, не проводились. Какая форма вирусного гепатита наблюдается у детей? Какую специфическую профилактику необходимо провести всем, кто контактировал с больными? Какие исследования позволят уточнить диагноз? 2. Диагностика гепатита В часто основана на выявлении НВs-антигена в сыворотке больных. С помощью какой серологической реакции это может быть сделано. Как получают необходимые реактивы? 3. После инъекций у беременной женщины развился гепатит, который характеризовался тяжелым течением и сопровождался внутренними кровотечениями. Какой именно вирусный гепатит можно заподозрить у больной. Какие методы лабораторной диагностики можно использовать?

4.К врачу-терапевту обратился мужчина с жалобами на постепенное повышение температуры, частый желудочное расстройство, снижение веса. Появились отеки нижних конечностей, лимфоузлы увеличены. Ранее ничем кроме ОРЗ не болел. Несколько месяцев назад больной вернулся из командировки в Центральную Африку. Находясь в командировке он был травмирован и 8 дней находился в госпитале. Оценивая анамнез и клиническую картину врач заподозрил у больного СПИДом. Как подтвердить или опровергнуть клинический диагноз? Как возможный путь заражения? Какие препараты следует применить, если диагноз подтвердится?

Приложение 2

Образец протокола:

1. Методы диагностики гепатита А.

Метод	Срок использования
Исследование фекалий
Исследования ферментов
Исследование IgM
Исследование IgG

Задание 2. Диагностика гепатита В. а) выявление НВs-антигена в исследуемой сыворотке Условные обозначения: 1. 2. 3. 4. 5. Рис.4. Реакция двойной иммунной диффузии Вывод: ___________________________________________________________. б) Использование серологических маркеров в диагностике гепатита В

Название маркера	Срок использования

Задание 3. Свойства возбудителей вирусных гепатитов

вирус	Тип НК и наличие суперкапсида	Антигены	Пути заражения	Инкубационный период	Осложнения	Методы диагностики
HAV
HBV
HDV
HCV
HEV

4.Серологическая диагностика ВИЧ-инфекции в ИФА. Реактивы, используемые на первом этапе: 1. __________________________ 2. __________________________ 3. __________________________ Описание I этапа _____________________________________________ _____________________________ Реактивы, используемые на втором этапе: И 4. ___________________________ Описание II этапа _________________________________________ _____________________________ Реактивы, используемые на третьем этапе: 5. __________________________ 6. __________________________ Описание результатов ________________________________________ _____________________________ Подтверждение с помощью иммуноблоттинга результатов, полученных в ИФА I этап __________________ Материалы, реактивы, оборудование ___________________________________ Сущность И этапа___________________________________________________ II этап __________________ Материалы, реактивы, оборудование ___________________________________ Сущность II этапа ___________________________________________________ III этап __________________ Материалы, реактивы, оборудование ___________________________________ Сущность III этапа ___________________________________________________ Учет результатов ______________________________________________ 5.Иммунологические изменения у больного СПИДом Факторы неспецифической резистентности ___________________________________ Т-система иммунитета _____________________________________________________ В-система иммунитета ____________________________________________________ Дата _____________ Подпись преподавателя _________________________  

Приложение 3.

Современные методы иммунодиагностики

За последние годы в практику вошли новые иммунологические методы диагностики - радиоиму-ный анализ (РИА) и иммуноферментный анализ (ИФА), позволят проводить имунодиагностикы в тех случаях, когда традиционные реакции иммунитета не дадут удовлетворительного результата. РИА и ИФА используются для постановки "невидимых" реакций иммунитета, для вра-учетом которых применяются метки: радиоизотопы или ферменты, способные коньюгуваты с иму-нореагентамы, сохраняя их специфичность и активность. Особенно широкое распространение получил более прост в постановке и учете иммуноферментный анализ. Реакция протекает с прикреплением одной из реагентов на поверхности пробирки или лунки. Поэтому такие реакции называют твердо фазными. В качестве твердой фазы наиболее более часто используются пробирки или панели из поливинила или полистирола, дно которых обрабатывается специальными веществами, благоприятными адсорбции антигена или антитела. Прикрепления к твердой фазы осуществляется либо при изготовлении панели или в начале по-становки опыта. Общее название таких панелей - панели имунолон.

Принцип реакции ИФА

На первом этапе на панели имунолон (на твердой фазе) адсорбируется известный антиген - если необходимо определить антитела, или неизвестный антиген - возбудитель заболевания, в па-тологичному материале от больного. Добавляется соответственно сыворотка больного (неизвестные антитела а) или диагностическая кроличья сыворотка (известны антитела). Обозначим антитела в этой реакции АТ-1. Смесь инкубируется, отмывается от компонентов, которые не прореагировали. На втором этапе к системе добавляется антиглобулинова сыворотка (АО-2), меченая фе-рментом пероксидазой хрена (ПХ). Производится повторная инкубация для соединения АТ-2 со своим антигеном АТ-1, промывки и переход к третьему этапу. Третий этап - индикаторный. К системе прилагается хромогенный субстрат - ортофен-лендиамин, растворенный в буфере вместе с перекисью водорода. При сохранении в системе ферме-НТУ (положительная реакция) последний восстанавливает Н2О2 к Н2О и окисляет субстрат - донор элек-Рона. При этом появляется коричнево-желтую окраску, которая учитывается на спектрофо-тометра или на глаз. Схематично реакцию ИФА можно изобразить: I этап: АГ + АТ-1 II этап: АТ-1 + (АТ-2 + ПХ) III этап: ПХ + субстрат с Н2О2 Изменяется окраска Где: АГ - антиген, АТ-1 - антитела больного или известные кроличьи антитела, АТ-2 - антитела антиглобулинови, ПХ - пероксидаза из хрена (фермент), Субстрат с Н2О2 - ортофенилендиамин с перекисью водорода. Тест-система ИФА для определения антител к вирусу СПИДа В систему входят: Для первого этапа: 1. Планшеты - твердая фаза с коньюгованим антигеном вируса СПИДа. 2. Сыворотка, содержащая антитела к вирусу СПИДа - положительный контроль. 3. Сыворотка, не содержащей антитела к вирусу СПИДа. На первом этапе в одну лунку помещают сыворотку больного, во вторую и третью лунки - контрольные сыворотки. Смесь инкубируется и отмывается. Для второго этапа: 4. Антиглобулинова сыворотка (АО-2), содержащей антитела против иммуноглобулинов человека и меченые пероксидазой. Смесь инкубируется и промывается. Для третьего этапа: 5. Индикатор ортофенилендиамин с перекисью водорода для выявления фермента при положительной реакции. 6. Нормальная кроличья и бычья сыворотки включены в состав реактивов для приготовления буферных растворов. Иммуноблотинг. Для подтверждения результатов, полученных методом ИФА, используют метод иму-нохимичного анализа белков, основанный на специфической взаимодействия сывороток с электрофаретично разделенными белками вируса. Принцип метода заключается в том, разделенных методом электрофареза белки переносятся на нитроцеллюлозные фильтры и затем методом ИФА вы назначается специфическое взаимодействие иммунных сывороток с отдельными белками вириона. Его осно-равными этапами являются: 1) электрофарез вирусных белков в полиакриламидном геле - гель заливают между стеклянными пластинами, вирусные белки диссоциируют в буферном растворе и наносят на гель, добавив раствор бромфенолового синего, електрофарез осуществляют в приборе модели studier и др. при постоянном напряжении поездом 17-18 часов, 2) электропереноса из геля на нитро-целлюлозный фильтр - гель помещают на нитроцеллюлозных фильтр и покрывают его с двух сторон несколькими слоями фильтровальной бумаги, "сэндвич" помещают между катодом и анодом и проводят электропереноса течение 2 часов; 3) иммунодетекции - определение наличия антител к белкам ВИЧ в исследуемых сыворотках, этот этап включает блокирование мест связывания на нитроцеллюлозы, инкубацию с исследуемой сывороткой, удаление реагента, не связались, добавление индикаторного комплекса, содержит конъюгированный белок А золотистого стафилококка и пероксидазу хрена, повторное отмывания от лишних реагентов, проявления реакции в субстратного растворе из перекиси водорода и хромогена. Учет результатов проводится визуально с появлением окрашенных полосок на нитроцеллюлозы. У больных СПИДом практически во всех случаях определяются антитела к gp41, а антитела к р24 менее часто. В бессимптомных носителей ВИЧ антитела к р24 выявляются ча-стише, чем антитела к gp41. При проведении реакции необходимо использовать позитивную и негативную сыворотки для сравнения с полученными результатами и для подтверждения пра-вильности постановки реакции.

8