Gosudarstvennaya_farmakopeya_RB

5.6. ОТЧЕТ ОБ ИССЛЕДОВАНИИ ИНТЕРФЕРОНОВ

Данный раздел публикуется для информации.

1. ВВЕДЕНИЕ

Частные статьи по интерферонам человека описывают главным образом исследования, основанные на ингибиторной активности интерферона в

отношении цитопатического действия вируса в культуре клеток. Однако если она описывает более одного подкласса интерферона, то в большинстве случаев сам вирус, культура клеток и детали исследования не определены с точностью,

необходимой для обеспечения достаточной вариабильности.

Данный текст представляет собой основную информацию для исследователя

относительно того, как планировать, оптимизировать и валидировать подобные исследования после того, как будет определена комбинация культуры клеток и цитопатического вируса. Подробная процедура для цитопатического

антивирусного анализа приводится в качестве примера подходящего метода наряду с информацией по другим комбинациям вирус-клеточная линия и

руководством по адаптированию и валидированию данной процедуры для аналогичных комбинаций.

2. АНТИВИРУСНЫЕ (СНИЖАЮЩИЕ ЦИТОПАТИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ) ИССЛЕДОВАНИЯ.

Антивирусные исследования человеческих интерферонов основываются на

индукции клеточной реакции в клетках человека, которая предотвращает или снижает цитопатический эффект инфекционного вируса. Сила действия

интерферона оценивается путем сравнения его защитного эффекта против вирусного цитопатического эффекта с подобным эффектом соответствующего

референтного препарата, калиброванного в Международных единицах.

3. ИССЛЕДОВАНИЕ ИНТЕРФЕРОНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КЛЕТОК Hер2C и

ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО ЭНЦЕФАЛОМИОКАРДИТА

Данное антивирусное исследование интерферонов человека описывает

цитопатический эффект редукционного типа. В нем используются клетки человека Hep2c, инфицированные вирусом энцефаломиокардита, для определения

эффективности различных экспериментальных препаратов человеческого

интерферона. Этот анализ использовался в трех международных исследованиях

под эгидой Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) как вариант международных стандартов для человеческого интерферона альфа,

человеческого интерферона бета и человеческого интерферона гамма и проявил себя как чувствительный, надежный и воспроизводимый метод для оценок

эффективности различных типов человеческого интерферона.

Для культур клеток млекопитающих все процедуры выполняются с

использованием стандартных операционных процедур по поддержанию

клеточных линий в культуре. Объемы реагентов обозначены для клеточных

культур, выполняемых в 75 cм2 колбах. Могут использоваться другие типы контейнеров, но при этом необходимо соответствующим образом откорректировать объем.

3.1. ХРАНЕНИЕ И ПОДГОТОВКА КЛЕТОК Heр 2c.

Клетки Hep2c содержатся и пересеваются в культуральной среде А. Клетки

хранятся в замороженном виде с использованием стандартных операционных процедур. Растущие клетки могут пересеваться в культуре до 30 пассажей, после

чего новую культуру получают из замороженного материала.

В начале исследования из колб берут клетки, образующие 90 % сплошной монослой, используя трипсиновую обработку, описанную ниже.

Из колб удаляют культуральную среду, затем в каждую колбу добавляют 5

мл раствора трипсина, нагретого до 37 C (раствор трипсина содержит 4 мг/мл

трипсина Р и 4 мг/мл натрия эделата Р).

Непосредственно перед использованием раствор трипсина разводят 50 объемами фосфатного буфера. Колбу, закрытую пробкой, взбалтывают для

промывки клеточного монослоя. Излишки трипсинового раствора убирают.

Колбы выдерживают 5-10 мин при температуре 37 C. Визуально или через

микроскоп наблюдают за клетками на предмет появления признаков разделения. При наблюдении в микроскоп видно, как клетки округляются или разделяются и свободно плавают.

Энергично встряхивают колбы для разделения всех клеток, добавляют приблизительно 5 мл культуральной среды А, еще раз встряхивают для

получения суспензии отдельных клеток.

При приготовлении суспензии для процедуры анализа необходимо

тщательно разделить клетки с помощью пипетки, чтобы разрушить клеточные

композиты. Подсчитывают количество клеток и ресуспендируют их в культуральной среде до концентрации 6·105 клеток/мл.

3.2. ВОСПРОИЗВЕДЕНИЕ ВИРУСА ЭНЦЕФАЛОМИОКАРДИТА

Вирус энцефаломиокардита (ЭМКВ) воспроизводится в культуре клеток

мышей L-929. Клетки L-929 получают с использованием трипсинизации, как это

описывалось для клеток Hep2c (Примечание: при слабом росте клеток может

возникнуть необходимость замены неонатальной телячьей сыворотки на

эмбриональную коровью сыворотку).

Берут несколько колб со сплошным монослоем культуры клеток L-929. Удаляют среду из колб. Добавляют 2 мл суспензии ЭМКВ, разбавленной в культуральной среде В таким образом, чтобы она содержала приблизительно 2,5·108 бляшкообразующих единиц (БОЕ) на миллилитр. Каждая колба должна содержать 4-6·107 L-929 клеток и, таким образом, инфекционность будет составлять 10 БОЕ/клетку. Осторожно взбалтывают вирусную суспензию, распределяя по клеточному монослою, и ставят колбы в термостат

приблизительно на один час. Поддерживают pH среды от 7,4 до 7,8.

После адсорбции ЭМКВ, добавляют приблизительно 40 мл культуральной

среды в каждую колбу и возвращают колбы в инкубатор с температурой 37°C приблизительно на 30 ч. Поддерживают pH среды от 7,4 до 7,8 с целью получения максимального количества вируса. По окончании инкубации удаляют культуральную жидкость и хранят её при температуре приблизительно 40 C.

Колбы охлаждают до температуры −20 C, чтобы заморозить клеточный

монослой. Затем нагревают до комнатной температуры. Добавляют приблизительно 5 мл культуральной среды и встряхивают колбу, чтобы разрушить

стенки клеток. Содержимое каждой колбы переносят в контейнер с культуральной жидкостью. Затем культуральную жидкость, содержащую ЭМКВ, переносят в 50 мл пластиковые центрифужные пробирки и центрифугируют при ускорении 500 g

около 10 мин. Очищенную культуральную жидкость распределяют по стеклянным

контейнерам с закручивающейся пробкой в количествах 20 мл, 10 мл, 5 мл, 1 мл, 0,5 мл или 0,2 мл, в соответствии с необходимостью. Хранят при −70 C.

При необходимости большие объемы можно размораживать и распределять по меньшим объемам и повторно замораживать.

При постоянном хранении приблизительно при температуре −70 C ЭМКВ сохраняет свой первоначальный титр, но повторяющиеся циклы замораживания- размораживания или хранение при более высоких температурах, например, при −20 C, приводят к прогрессирующей потери титра.

3.3. ПРОЦЕДУРА ИССЛЕДОВАНИЯ

3.3.1. Определение уровня доза-ответ

Приготовление растворов

Стандарт интерферона (например специфический подтип стандарта ВОЗ интерферона) разводят в культуральной среде А, в 10-ти кратных разведениях таким образом, чтобы доза была в диапазоне 1000 – 0,001 МЕ/мл. Процедура исследования выполняется в 96 ячеечном микротитровом планшете. В каждую ячейку добавляют 100 мкл культуральной среды А. Затем в каждую ячейку, за

исключением тех, которые предназначены для вирусных контролей, добавляют приблизительно 100 мкл каждого раствора препарата сравнения, используя

многоканальные пипетки на 100 мкл. Содержимое ячеек перемешивают.

Распределение клеточной суспензии

Суспензию клеток Hep2c, содержащую приблизительно 6·105 клеток/мл клеточной культуры А, разливают в пластиковые чашки Петри.

Используя многоканальную пипетку на 100 мкл, переносят клеточную суспензию из чашек Петри в каждую ячейку многотитровых планшетов. Помещают

планшеты приблизительно на 24 ч в инкубатор, установленный на 37°C и

содержащий 5% углерода диоксида.

Вирусная инфекция

На этом этапе, используя микроскоп, проверяют, чтобы монослои клеток Hep2c были сплошными, имели правильную морфологию и были живыми.

Удаляют большую часть культуральной среды, перевернув планшет, встряхнув его и промокнув бумажным полотенцем (процедура идентична той, что описывается ниже по удалению жидкости из микротитровых планшетов). Разводят ЭМКВ свежей культуральной средой А до титра приблизительно 3·107 БОЕ/мл

(Примечание: в каждом планшете должно быть около 20 мл вирусной суспензии

плюс от 5 до 10% сверх объема ).

Разведенную суспензию, полученную из 9 см стерильных чашек Петри,

распределяют, используя многоканальные пипетки, установленные на 200 мкл, во все ячейки, включая вирусные контроли, за исключением клеточных контролей. Добавляют приблизительно 200 мкл культуральной среды А без вируса в каждую ячейку с клеточным контролем.

Планшет помещают в термостат, установленный на 37°C и содержащий 5%

углерода диоксида на 24 ч.

Окрашивание

Планшеты проверяют через микроскоп на предмет того, что ЭМКВ вызвал цитопатический эффект (ц.п.э.) в вирусных контролях. Временной интервал для

максимального ц.п.э. может варьировать от одного исследования к другому

вследствие характерных изменений клеток Hep2c на введение вируса в течение данного периода непрерывного культивирования.

Большую часть культуральной среды удаляют из ячеек в соответствующий дезинфицирующий раствор (например, натрия гипохлорит). В каждую ячейку

добавляют солевой фосфатный буфер рН 7,4 Р. Сливают солевой фосфатный буфер рН 7,4 Р в дезинфицирующий раствор. В каждую ячейку добавляют 150 мкл окрашивающего раствора. Клетки окрашивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Сливают окрашивающий раствор в дезинфицирующий раствор.

Распределяют приблизительно 150 мкл фиксирующего раствора. Фиксируют в течение 10 мин при комнатной температуре. Сливают фиксирующий раствор в

дезинфицирующий раствор и промывают клеточный монослой, погрузив планшеты в пластиковые контейнеры с проточной водой. Удаляют воду и

промокают планшеты бумажными полотенцами. Высушивают планшеты при температуре от 20 C до 37°C до тех пор, пока не испарится вся влага.

В каждую ячейку добавляют 150 мкл 0,1 M раствора натрия гидроксида Р.

Элюируют краску аккуратным встряхиванием планшетов или постукиванием ладонью руки. Перед тем, как снимать спектрометрические показания, необходимо убедиться, что краска равномерно распределилась по всем ячейкам. Снимают показания при длине волны от 610 нм до 620 нм, используя считыватель

микротитрового планшета, а в качестве слепой пробы - ячейку или ряд ячеек, содержащих около 150 мкл 0,1 M натрия гидроксида Р и не содержащих клеток.

Определяют концентрации интерферон-стандарта, которые вызывают

максимальное и минимальное снижение цитопатического эффекта. Это и есть дозовая зависимость, соответствующая рабочему интервалу исследования.

3.3.2.Процедура исследования

Исследование проводят в соответствии с тем, как описано выше, используя

вкачестве растворов:

-вещество для исследования, разбавленное двумя объемами культуральной среды А для достижения номинальных концентраций,

охватывающих рабочий диапазон исследования;

-в качестве растворов сравнения используют соответствующий стандарт интерферона (например, специфический подтип интерферона ВОЗ), разведенный

в двух объемах культуральной среды А для достижения номинальных концентраций, охватывающих рабочий диапазон исследования.

3.3.3. Анализ данных

Результаты исследования снижения цитопатического эффекта в основном соответствуют сигмоидальному графику доза-ответ, когда функция представлена

графически - концентрация интерферона (логарифм обратной величины разведения интерферона) к поглощению красителя.

Строят график функции концентрации интерферона (логарифм обратной величины разведения) к поглощению красителя для стандартного препарата

интерферона и для экспериментальных растворов интерферона. Используя

линейный участок графика, рассчитывают концентрацию интерферона в образце путем сравнения реакций для экспериментального и стандартного растворов,

используя обычные статистические методы для параллельного анализа.

4. ВАЛИДАЦИЯ ДРУГИХ ПРОЦЕДУР

4.1.ВЫБОР КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР И ВИРУСА

Вантивирусных исследованиях интерферона использовался целый ряд других комбинаций клеточных культур и вирусов. Например, EMCV использовался

в комбинации с эпителиальной клеточной культурой A549 карциномы легких, вирус Semliki Forest или вирус Sindbis использовались с фибробластами человека, с клеточной культурой амниона человека, вирус WISH или Madin-Darby с почечной клеточной культурой крупного рогатого скота. В каждом случае выбор

комбинации клеточная культура/вирус основывается на том, какая из них дает наиболее чувствительный ответ на препарат интерферона, предназначенный для

исследования, и дает параллельные реакции при сравнении экспериментального препарата и интерферонового стандарта.

4.2.ВЫБОР РЕАКЦИИ

Процедура окрашивания, описанная выше, оценивает оставшиеся жизнеспособные клетки. Кроме того, применялся целый ряд других реакций,

включая окрашивание метиленовым синим или кристаллическим фиолетовым или преобразование тиазолинового синего (МТТ). В каждом случае выбор метода

основывался на получении подходящей линейной и чувствительной зависимости между реакцией цвета и количеством жизнеспособных клеток.

4.3. СТАТИСТИЧЕСКОЕ ПОДТВЕРЖДЕНИЕ ДОСТОВЕРНОСТИ

Как и в случае с параллельными биоанализами, данное исследование должно соответствовать обычным статистическим критериям линейности реакции, параллелизма и дисперсии.

4.4. ВАЛИДАЦИЯ ПЛАНИРОВАНИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

Как и в случае с процедурой микротитрового планшета, необходимо

уделять внимание планированию исследования. В частности, необходимо

предусмотреть и исключить системные ошибки в результате неслучайного порядка пипетирования и других факторов.

РЕАГЕНТЫ И КУЛЬТУРАЛЬНАЯ СРЕДА
Культуральная среда A (10% неонатальная телячья сыворотка)
RPMI 1640 культурная среда, дополненная при необходимости
антибиотиками (пенициллин 10000 МЕ/мл; стрептомицин 10 нг/мл)	- 450мл
L-глютамин, 200 мМ, стерильный	-	5мл
Культуральная среда B (2% эмбриональной коровьей сыворотки)	- 490мл
RPMI 1640 культуральная среда, дополненная при необходимости
антибиотиками (пенициллин 10000 МЕ/мл; стрептомицин 10нг/мл)
L-глютамин, 200 мМ, стерильный	-	5мл
Эмбриональная коровья сыворотка	- 10мл
Окрашивающий раствор
Нафталин черный	- 0,5 г
Кислота уксусная ледяная	- 90 мл
Натрия ацетат безводный		- 8,2 г
Вода	-1000 мл

Фиксирующий раствор
Формальдегид 40 %	-100 мл
Кислота уксусная ледяная	- 90 мл
Натрия ацетат безводный	- 8,2 г
Вода	- 1000 мл

5.7. ТАБЛИЦА ФИЗИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК РАДИОНУКЛИДОВ, УПОМИНАЕМЫХ В ФАРМАКОПЕИ

Следующая таблица приведена в дополнение к общей статье

Радиофармацевтические препараты (0125).

Данные взяты из базы данных National Nuclear Data Center (NNDC) Brookhaven National Laboratory, Upton. N.Y., USA, а также размещены в Интернете по адресу: ”http://www.nndc.bnl.gov/nndc/nudat/radform.html”.

Втом случае, когда был использован другой источник информации (более современные знания), это указывается.

Другие источники информации:

*DAMRI (Département des Applications et de la Métrologie des Rayonnements Ionisants, CEA Gif-sur-Yvette, France),

** PTB (Physikalisch-Technische Bundesanstalt, Braunschweig, Germany),

*** NPL (National Physical Laboratory, Teddington, Middlesex, UK).

Отклонение в периоде полураспада дается в круглых скобках, цифра в круглых скобках является стандартным отклонением, соответствующей последней цифре, в соответствии с “Руководством по выражению отклонения в измерениях”, Международной организации по стандартизации (ISO), 1993, ISBN 92-67-10188-9).

Втексте используются следующие аббревиатуры:

eА – возбужденные электроны, се – конверсионные электроны, β- - электроны, β+ - позитроны,

γ – гамма-излучение, Х – рентгеновское излучение.

				Эмиссия электронов				Эмиссия фотонов
						Вероят-			Вероят-
Радионуклиды	Период					ность			ность
						эмиссии		Энергия	эмиссии
	полураспада	Вид			Энергия (мЭв)		Вид
						(на 100		(мЭв)	(на 100
						распа-			распа-
						дов)			дов))
Тритий (3Н)	*12,33 (6) г	*βˉ			*0,006 (I) (макс:	*100
					0.019)
Углерод-11 (11С)	20,385 (20) мин	β+			0,386(I) (макс:	99,8	γ	0,511	199,5 (II)
					0,960)
Азот-13 (13N)	9,965 (4) мин	β+			0,492(I) (макс:	99,8	γ	0,511	199,6 (II)
					1,198)
Кислород-15	122,24 (16) с	β	+		0,735(I) (макс:	99,9	γ	0,511	199,8	(II)
(15O)					1,732)
Фтор-18 (18F)	109,77 (5) мин	β+			0,250(I) (макс:	96,7	γ	0,511	193,5 (II)
					0,633)
Фосфор-32 (32P)	14,26 (4) сут	βˉ			0,695(I) (макс:	100
					1,71)
Фосфор-33 (33P)	25,34 (12) сут	βˉ			0,076(I) (масс:	100
					0,249)
Сера-35 (35S)	87,51 (120) сут	βˉ			0,049(I) (макс:	100
					0,167)
	27,7025 (24)	eА			0,004	67	Х	0,005	22,3
Хром-51 (51Cr)	сут						γ	0,320	9,9

(I) Имеется в виду β спектр.

(II) Максимальная вероятность эмиссии, относящейся к суммарной иннигиляции в источнике на 100 распадов.

			Эмиссия электронов				Эмиссия фотонов
					Вероят-			Вероят-
Радионуклиды	Период				ность			ность
					эмиссии		Энергия	эмиссии
	полураспада	Вид		Энергия (мЭв)		Вид
					(на 100		(мЭв)	(на 100
					распа-			распа-
					дов			дов
	77,27 (3) сут	eА		0,006	47	X	0,006–0,007	25
		β+		0,179(I)	0,9	γ	0,511	38,0 (II)
				0,631(I)	18,1		0,847	100,0
							1,038	14,1
							1,175	2,2
Кобальт-56							1,238	66,1
(56Со)							1,360	4,3
							1,771	15,5
							2,015	3,0
							2,035	7,8
							2,598	17,0
							3,202	3,1
							3,253	7,6
	271,79 (9) сут	eА + се		0,006 – 0,007	177,4	X	0,006-0,0007	57
Кобальт-57		се		0,014	7,4	γ	0,014	9,2
(57Со)				0,115	1,8		0,122	85,6
				0,129	1,3		0,136	10,7
							0,692	0,15
	70,86 (7) сут	eА		0,006	49,4	X	0,006-0,007	26,3
Кобальт-58		β+		0,201(I)	14,9	γ	0,511	29,9(II)
(58Со)							0,811	99,4
							0,864	0,7
							1,675	0,5
Кобальт-60	5,2714 (5) г	βˉ		0,096(I) (макс:	99,9	γ	1,173	100,0
				0,318)			1,333	100,0
(60Со)

(I) Имеется в виду β спектр.

(II) Максимальная вероятность эмиссии, относящейся к суммарной иннигиляции в источнике на 100 распадов.

			Эмиссия электронов				Эмиссия фотонов
					Вероят-			Вероят-
Радионуклиды	Период			Энергия	ность		Энергия	ность
					эмиссии			эмиссии
	полураспада	Вид				Вид
				(мЭв)	(на 100		(мЭв)	(на 100
					распа-			распа-
					дов)			дов)
	9,49 (7) ч	eА		0,008	21	Х	0,009-0,010	19,1
		β+		0,157(I)	1	γ	0,511	112(II)
				0,331(I)	0,7		0,834	5,9
				0,397(I)	3,8		1,039	37
				0,782(I)	0,3		1,333	1,2
				1,90(I)	50		1,919	2,1
Галлий-66 (66Ga)							2,190	5,6
							2,423	1,9
							2,752	23,4
							3,229	1,5
							3,381	1,5
							3,792	1,1
							4,086	1,3
							4,295	4,1
							4,807	1,8
	3,2612 (6) сут	eА		0,008	62	Х	0,008-0,010	57
		се		0,082-0,084	30,4	γ	0,091-0,093	42,4
Галлий-67				0,090-0,092	3,6		0,185	21,2
(67Ga)				0,175	0,3		0,209	2,4
							0,300	16,8
							0,394	4,7
							0,888	0,15
Германий-68	270,82 (27) сут	eА		0,008	42,4	Х	0,009-0,010	44,1
(68Ge) в		β+		0,353(I)	1,2	γ	0,511	178,3
равновесии с
	(68Ga: 67,629			0,836(I)	88,0		1,077	3,0
Галлий-68 (68Ga)
	(24) мин)
	67,629 (24) мин	eА		0,008	5,1	Х	0,009-0,010	4,7
Галлий-68 (68Ga)		β+		0,353(I)	1,2	γ	0,511	178,3
				0,836(I)	88,0		1,077	3,0
Криптон-81m	13,10 (3) с	се		0,176	26,4	Х	0,012-0,014	17,0
				0,189	4,6
(81mKr)
						γ	0,190	67,6

(I) Имеется в виду β спектр.

(II) Максимальная вероятность эмиссии, относящейся к суммарной иннигиляции в источнике на 100 распадов.

			Эмиссия электронов					Эмиссия фотонов
					Вероят-				Вероят
	Период					ность			ность
Радионуклиды					эмисси			Энергия	эмис-
	полураспада	Вид		Энергия (мЭв)		и (на	Вид		сии (на
								(мЭв)
						100			100
						распа-			распад
						дов)			ов)
	4,576 (5) ч	eА		0,011		31,3	Х	0,013-0,014	57,2
Рубидий-81		се		0,176		25,0	γ	0,190	64
(81Rb) в				0,188		4,3		0,446	23,2
равновесии с								0,457	3,0
Криптон-81m
		β+		0,253(I)
(81mKr)						1,8		0,510	5,3
	(81mKr: 13,10			0,447(I)		25,0		0,511	54,2
	(3) с)							0,538	2,2
	50,53 (7) сут	βˉ		0,583(I) (макс:		99,99	γ	0,909	0,01
Стронций-89				1,492)
(89Sr) в
равновесии с
Иттрий-89m	(89mY: 16,06
(89mY)	(4) с)
	28,74 (4) г	βˉ		0,196(I) (макс:		100
Стронций-90				0,546)
(90Sr) в
равновесии с	(90Y: 64,10
Иттрий-90 (90Y)
	(8) ч)
Иттрий-90 (90Y)	64,10 (8) ч	βˉ		0,934(I) (макс:		100
				2,280)
	65,94 (1) ч	βˉ		0,133(I)		16,4	Х	0,018-0,021	3,6
				0,290(I)		1,1
Молибден-99				0,443(I)		82,4	γ	0,041	1,1
(99Мо) в								0,141	4,5
равновесии с								0,181	6
Техниций-99m
	(99mTc: 6,01
(99mTc)								0,366	1,2
	(1) ч)							0,740	12,1
								0,778	4,3
	6,01 (1) ч	се		0,002		74	Х	0,018-0,021	7,3
Технеций-99m		eА		0,015		2,1	γ	0,141	89,1
(99mTc)
		се		0,120		9,4
				0,137-0,140		1,3
Технеций-99	2,11 × 105 г	βˉ		0,085(I) (макс:		100
(99Tc)				0,294)

(I) Имеется в виду β спектр.

(II) Максимальная вероятность эмиссии, относящейся к суммарной иннигиляции в источнике на 100 распадов.