4 Вопрос

Тесты in vitro для диагностики lgЕ-опосредованных заболеваний

ЛАБОРАТОРНЫЕ ТЕСТЫ

ПРИСТ - прямой радиоиммуносорбентный тест

Тест для определения общего IgE в сыворотке крови. Используют технику, при которой нерастворимые иммуносорбенты с "пришитыми" антиIgЕ-антителами в течение 16 часов инкубируют либо со стандартом, либо с исследуемой сывороткой. Затем несвязанные IgE-антитела сыворотки удаляют отмыванием, после чего в течение 2-4 часов инкубируют с меченными 125J aнтиIgE-антителами. Несвязанные 125J антиIgЕ антитела снова удаляют отмыванием. По связанной радиоактивности определяют количество общего Ig E. Радиоактивное мечение изотопом 131J, а в последнее время все чаще 125J - это многократно проверенный и надежный метод. Однако из-за того, что необходимые в этом случае реагенты опасны для здоровья и нестабильны в результате радиоактивного распада, были предложены и другие типы меток. Успешно применяют ферменты, в частности пероксидазу и фосфотазу, которые при добавлении к реагирующим компонентам соответствующего бесцветного субстрата, называемого хромогеном, воздействуют на последний с образованием окрашенных продуктов реакции. На использовании ферментов основан, в частности, метод определения антител, а иногда и антигенов, называемый ELISA (от англ.  enzyme  linked immunosorbent assay)  - твердофазный иммуноферментный анализ - ИФА. Прямой метод выявления специфических Ig Е-антител: Радиоаллергосорбентный тест (PACT) Используют для количественной оценки антигенспецифических Ig Е-антител. Принцип метода: содержание специфических Ig Е антител в сыворотке можно установить, используя их способность связываться с антигеном (аллергеном), находящимся на нерастворимом сорбенте-носителе.   Если   в   используемой   сыворотке   содержатся соответствующие антитела, то после инкубации они взаимодействуют с аллергенами. Несвязанные антитела сыворотки удаляют путем отмывания и оставшийся комплекс инкубируют с Ig Е-антителами, меченными 125J. В том случае, если ранее (на 1 этапе реакции) произошло связывание реагинов с аллергенами, то молекулы 125J aнтиIgE взаимодействуют с этими реагинами. Несвязанные 125J aнтиIg E удаляют отмыванием. Количество антигенспецифических антител определяют по связанной радиоактивности, используя соответствующие стандарты. Преимущества PACT по сравнению с кожными пробами: больной тратит меньше времени на исследование; на результаты не влияют принимаемые лекарственные препараты; выполнение теста не связано с риском развития у больного анафилаксии; есть возможность количественной оценки. Недостатки PACT: не выявляет иных антител-реагинов, кроме IgE. Примечание: PACT хорошо коррелирует с другими пробами, особенно провокационными. По сравнению с внутрикожными пробами PACT является менее чувствительным, но более специфичным, то есть практически не дает ложноположительных результатов PACT предпочтителен у детей до 5 лет, у которых кожные пробы непрактичны, у больных экземой, которым они противопоказаны и при патологическом дермографизме, когда результаты проб ложноположительные. Иммуноферментный анализ (ИФА) ИФА может быть использован для количественной оценки общего Ig E в сыворотке крови. Метод основан на принципе "сандвича". К сорбированным на твердой фазе антиIgE-антителам добавляют испытуемую пробу сыворотки, инкубируют, отмывают. Затем сюда же вносят конъюгат антиIgЕ-антител с ферментом в расчете на то, что этот конъюгат может связаться со вторым свободным активным центром IgE-антител, находящихся в составе иммунных комплексов на твердой фазе. Затем стадии инкубации и отмывки, после чего вносят субстрат (хромоген), соответствующий использованному    ферменту.    О    превращении    субстрата свидетельствует изменение цвета в лунке или в пробирке с твердой фазой, причем окрашивание происходит только при наличии в составе сендвич-комплексов на твердой фазе, а соответственно и в исследуемой сыворотке крови иммуноглобулина E. Интенсивность цветной реакции оценивают спектрофотометрически относительно положительной и отрицательной контрольных проб.