Приготування робочих розчинів для побудови калібрувальної кривої

Калібру-вальні точки	Кількість розчину білку, мл	Кількість 0,9% розчину NaCl, мл	Концентрація білку, г/л
1	0,2	0,8	20
2	0,4	0,6	40
3	0,6	0,4	60
4	0,8	0,2	80
5	1,0	0	100

Сутність побудови калібрувальної кривої зводиться до того, що певні

об’єми розчинів стандартних проб обробляються в умовах, повністю

ідентичні умовам аналізу дослідних проб.

Калібрувальна крива прокладається таким чином, щоб найбільша кількість точок розташовувалися на лінії, а решта – поблизу неї, рівномірно відхиляючись від неї. Окремі точки, що значно відхиляються від калібрувальної кривої, є наслідком грубих помилок під час визначення, виключаються із обліку.

Розташування кривої має бути таким, щоб вона виходила із нульової відмітки під кутом приблизно 45° до осей координат, адже за таких умов досягається найбільша точність вимірювань. Цьому сприяє також вибір достатньо великого масштабу.

За отриманим даними будують калібрувальний графік на міліметровому папері. На осі абсцис позначають значення концентрацій в г/л, на осі ординат – середні значення екстинкції для кожної концентрації білку. Через отримані точки проводять пряму лінію (рис.6.9.). Побудова калібрувального графіка проводиться не менше, ніж за 5 точками.

екстинкція

поглинання

оптична густина

концентрація білку, г/л

Рис. 6.9. Побудова калібрувального графіка

Іноді характер графіка для більшості концентрацій білку трохи відхиляється від прямої лінії, однак якщо результати стабільно повторюються, такий графік цілком придатний для роботи.

У правому верхньому куті аркуша із калібрувальним графіком вказують: назву калібрувальної кривої, метод дослідження, довжину хвилі (номер світлофільтра), довжину оптичного шляху (у мм), дату побудови калібрувальної кривої. Враховують також, що у більшості фотометрів найбільш оптимальною є область досліджень у межах 0,1- 0,3 (максимум – 0,7) од. абсорбції.

Калібрувальну криву потрібно час від часу перевіряти. При цьому досить перевірити 2–3 точки. Якщо вони укладаються на колишньому графіку, то він не переробляється.

Побудова калібрувальної кривої залежить від умов, що можуть впливати на її розміщення відносно осей системи координат, тобто, на порушення прямої залежності між концентрацією та величиною екстинкції:

- наявність у середовищі електролітів, що змінюють структуру молекул речовини або ж забарвлених розчинів;

- гідратація (сольватація), що впливає на поглинання розчином світлового потоку, адже зі зміною концентрації розчину змінюється і сам цей процес;

- неповна взаємодія досліджуваної речовини із реактивом при його розбавленні;

- зміни рН розчину, що впливає на повноту утворення та склад молекул забарвленої речовини.

Після побудови калібрувального графіка вимірюють оптичну щільність аналізованого розчину і по графіку визначають його концентрацію.