Хід роботи

На силуфоловій пластинці олівцем відмічають лінію старту (1,5-2 см від нижнього краю пластинки) та 4 точки для нанесення розчинів суміші відомих амі­нокислот та розчину невідомої суміші (рис. 1.4.).

За допомогою шприца на точки 1, 2, 3 наносять однакові об'єми розчину відомих амінокислот (по 3 краплі), причому кожну наступну краплину наносять після просушування попередньої на повітрі. На точку 4 наносять 4 краплини суміші невідомих амінокислот.

лінія

фінішу

лінія

х х х х старту

1 2 3 4

Рис. 1.4. Нанесення точок на силуфолову пластинку

Після нанесення всіх розчинів амінокислот пластинку висушують на повітрі і розміщують в герметичному контейнері (рис.1.5), на дно якого наливають шар розчинника (елюента) товщиною 1,0 см так, щоб нижній край пластинки був занурений на 0,5-1,0 см в розчинник. Необхідно слідкувати, щоб поверхня розчинника була нижче від лінії старту на 0,5-1 см. Верхній край пластинки закріплюють тримачем. Щоб уникнути випаровування елюента, хроматографію проводять в закритих камерах, що забезпечує рівновагу між рухомою рідкою фазою та її парами. Робота з органічними розчинниками прово­диться у витяжній шафі.

Рис.1.5. Типова камера для проведення хроматографічного розділення: 1 – розчинник; 2 – пластинка з шаром сорбенту; 3 - точка нанесення розчину суміші амінокислот; 4 – точки нанесення розчинів амінокислот; 5 – лінія фронту; 6 – лінія старту.

Відмічаємо час початку та закінчення хроматографії. Під час проведення хроматографії спостерігають за рухом фронту розчинника (розгонка). Хроматографія вважається закінченою, коли фронт руху розчинник знаходиться за 1-1,5 см від верхнього краю пластинки.

Після закінчення хроматографічного розд­ілення амінокислот пластину дістають з контейнера, висушують на повітрі в чистій витяжній шафі при кімнатній температурі. Щоб визначити місцезнаходження невидимих плям амінокислот, тобто проявити пластинку, її обробляють реактивами, специфічними для речовин що розділяються. У випадку амінокислотних сумішей пластину занурюють на кілька секунд у кювету з 0,5 %-м розчином нінгідрину в аце­тоні, просушують на повітрі і протягом 15 хвилин прогрівають для проявлення забарвлення в термостаті при 60 °С.

На проявленній та висушеній хроматограмі плями амінокислот обмальовують олівцем, щоб зберегти місцезнаходження окремих амінокислот, ідентифікують плями відомих амінокислот та визначають амінокислотний склад невідомої суміші, порівнюючи положення окремих її плям з положенням стандартів.

Вимірюючи відстань між лінією старту і центром плями кожної амінокислоти, знаходять величину хроматографічної рухомості R_f (відношення довжини пробігу кожної плями амінокислоти до довжини пробігу розчинника, яка вимірюється відстанню між стартовою лінією та лінією фінішу розчинника).