Завдання для виконання

1. Підготувати листок хроматографічного паперу для хроматографії (відмітити лінію старту та точки 1, 2, 3, 4).

2. Нанести 1, 2 та 4 обєми 0,01 М розчину амінокислоти на точки 1, 2, 3 (відповідно), причому кожну наступну порцію розчину наносять після повного висушування попередньої краплини. Занурити хроматограму на кілька секунд у кювету з 0,5%-м розчином нінгідрину в ацетоні.

3. Просушити хроматограму при кімнатній температурі та прогріти протягом 15 хв. для проявлення забарвлення в сушильній шафі при 60⁰ С.

5. Зони хроматограми з яскраво-ліловими плямами амінокислот вирізати, подрібнити та помістити в окремі пробірки №1, №2, №3 та №4.

6. Збоку на чистому місці вирізати рівний за розміром кружок з бумаги, що буде слугувати контролем, також подрібнити та вмістити в пробірку №5.

7. Елюювати комплексну сполуку амінокислоти з паперу в розчин.

8. Витримати пробірки протягом 30 хв. в темному місці при кімнатній температурі.

9. Фотометрувати проти контрольної проби на ФЕК при 540 нм (зелений), кювета 5 мм.

10. На основі знайденої оптичної густини взятих концентрації побудувати

калібрувальний графік, для чого на осі абсцис відкласти концентрацію амінокислот в мкмоль/мл, а на осі ординат – оптичну густину.

11. Знайти оптичну густину амінокислоти невідомої концентрації (пробірка №4) та за калібрувальним графіком визначити її концентрацію.

12.Написати висновок.

Контрольні запитання

1. Розподільна хроматографія на папері.

2. Види розподільної хроматографії на папері.

2. Нерухома фаза в розподільній хроматографії на папері.

3. Види хроматографічного паперу.

4. Яка реакція лежить в основі методу.

5. Суть методу кількісного визначення амінокислот.

6. В чому необхідність контрольного розчину.

7. Для яких амінокислот застосовується даний метод і чому.

РЕКОМЕНДОВАНА ЛІТЕРАТУРА

1. Лисенко, О.М. Вступ до хроматографічного аналізу. Навчальний посібник / О.М. Лисенко, Б.Й. Набиванець.- К.: Корвін Пресс, 2005. - 187 с.

2. Бёккер, Ю. Хроматография. Инструментальная аналитика: Методы хроматографии и капиллярного электрофореза / Ю.Бёккер. - М.: Техносфера, 2009.- 470 с.

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА 3

РЕАКЦІЇ ОСАДЖЕННЯ БІЛКІВ

Мета роботи: Вивчити методи осадження білків. Провести очистку яєчного глобуліну та альбуміну.

План

1. Функції та склад білків.

2. Фізико-хімічні властивості білків.

3. Реакції осадження білків.

4. Типи зв’язків в молекулі білка.

Сировина та реактиви

2 свіжих курячих яйця, кристалічний (NH₄)₂SO₄, насичений розчин (NH₄)₂SO₄.

Приготування насиченого розчину (NH₄)₂SO₄:

757 г солі розчиняють в 1 л води при слабкому нагріванні на водяній бані до повного насичення розчину (на дні колби повинен з'явитися осад нерозчиненої солі), закривают пробкою і старанно перемішують, при цьому осад повинен залишитися. Якщо осад розчиняється, необхідно додати кристалічної солі.

Матеріали та обладнання

Мірні циліндри з притертою пробкою на 50 та 100 мл, хімічні стакани на 50 мл, стакан на 500 мл, водострумний насос, ваги, водяна баня, ступка фарфорова з пестиками, штатив з пробірками, воронка Бюхнера, воронка скляна, скляні палички, фільтрувальний папір.

Загальні відомості

Білки́ — складні високомолекулярні природні органічні речовини, що складаються з амінокислот, сполучених пептидними зв'язками. Білки є лінійними полімерами — поліпептидами, хоча інколи мають складнішу структуру. Невеликі білкові молекули, тобто олігомери поліпептидів, називаються пептидами. Для досягнення певної функції білки можуть діяти спільно, і часто зв'язуються, формуючи великі стабілізовані  комплекси (наприклад, фотосинтетичний комплекс).

Молекулибілків є лінійнимиполімерами, що складаються з 22 типів основнихα-L-амінокислот(які ємономерамицих полімерів).

При утворенні білка в результаті взаємодії α-аміногрупи (-NH₂) однієї амінокислоти з α-карбоксильною групою (-СООН) іншої амінокислоти утворюються пептидні зв'язки. Кінці білка називаються С- і N- кінцями (залежно від того, яка з груп кінцевої амінокислоти вільна: -COOH чи -NH₂).

Послідовність амінокислот у конкретному білку визначається відповідним  геном і зашифрована  генетичним кодом. Ця інформація представлена у вигляді нуклеотидної послідовності, причому одній амінокислоті відповідає одна або декілька послідовностей з трьохнуклеотидів— так званихкодонів. Відповідність амінокислоти до певного кодона вДНКтамРНКвідрізняється у різних організмів.

Гомологічними називаються білки, що виконують одну функцію і мають загальнееволюційнепоходження. Наприклад, гомологічний білокгемоглобінрізних організмів має в багатьох місцях ланцюга різні амінокислотні залишки, які називають варіабельними, на противагу консервативним, спільним залишкам.

Структура білків.Виділяють чотири рівні структури білків (рис.3.1.).

Рис.3.1. Чотири рівні структури білків

Первинна структура—пептидна або амінокислотна послідовність, тобто послідовність амінокислотних залишків упептидномуланцюгу. Саме первинна структура кодується відповідним геном і найбільшою мірою визначає властивості сформованого білка.

Вторинна структура— локальне впорядковування фрагменту поліпептидного ланцюга, стабілізованеводневими зв'язкамиігідрофобними взаємодіями. Найпоширеніші типи вторинної структури білків включають:α-спіралі, стабілізовані водневими зв'язками між пептидними групами іβ-листи(кілька зигзагоподібних поліпептидних низок, в яких водневі зв'язки утворюються між відносно віддаленими ділянками ланцюга або між різними ланцюгами).

Третинна структура— повна просторова будова цілої білкової молекули, просторове взаємовідношення вторинних структур одна до одної. Третинна структура стабілізується нелокальними взаємодіями, формуваннямгідрофобного ядра, а також завдяки утворенню водневих зв'язків, солевих містків,іонних взаємодій,дисульфідних зв'язківміж залишкамицистеїну.До третинної структури зазвичай відносять і проміжні рівні між основними елементами вторинної структури та повною структурою білка — «надвторинну» структуру, що складається ізструктурних мотивівтадоменів.

Структурні мотиви — невеликі усталені поєднання кількох елементів вторинної структури, що мають схожу структуру, важливу для виконання білком певних функцій. Схожі структурні мотиви зазвичай виконують схожі функції. Домени— дещо більші елементи структури білка, що характеризуються стабілізацією незалежною від решти поліпептидного ланцюга, і часто виконують окрему функцію. В процесі еволюції елементи надвторинної структури можуть передаватися між генами або штучними методамигенної інженерії

Четвертинна структура— структура, що виникає в результаті взаємодії кількох білкових молекул, які називаютьсубодиницями. Повна структура кількох поєднаних субодиниць, що разом виконують спільну функцію, називаєтьсябілковим комплексом.

Прості і складні білки. За складом білки діляться на прості і складні. Прості білки містять тільки амінокислоти, зв'язані в ланцюги. На відміну від них складні білки мають, крім амінокислот, додаткові групи, які називаються простетичними групами. Деякі простетичні групи служатькофакторами, необхідними для роботи ферментів. Прикладами органічних простетичних груп в складі білків служатьгем(в складігемоглобіну, цитохромів),тіамін,біотинта інші. Неорганічні простетичні групи найчастіше складаються зіонівметалів, найпоширенішими з яких єцинк,магнійімолібден, залізо. За типом простетичної групи складні білки поділяють наглікопротеїни,ліпопротеїни,хромопротеїни,нуклеопротеїни,фосфопротеїни,металопротеїнита інші.

Функції білків в клітині різноманітніші, ніж функції інших  біополімерів — полісахаридів і нуклеїнових кислот. Так, ферментні білки  каталізують протікання біохімічних реакцій і грають важливу роль в обміні речовин. Деякі білки виконують структурну або механічну функцію, утворюючи  цитоскелет, що є важливим засобом підтримки форми клітин.

Класифікація білків за функцією може бути як біохімічною за типом біохімічної функції в організмі, так і заснованою на головних клітинних процесах. Класифікація включає:

- обробку та збереження інформації (процеси реплікації,експресії генівта підтримкигеному);

- клітинні процеси та сигнали (контроль клітинного циклу, підтримка структури клітини та органів, транспорт, модифікації макромолекул,сигнальні системи);

- метаболізм (отримання та перетворення енергії, синтез та транспорт ліпідів,амінокислот,цукрів, неорганічних молекул,вторинних метаболітів).

Білки виконують специфічні завдання залежно від інформації, закодованої у відповідних генах. За винятком певних типів РНКбільшість біомолекул часто розглядаються як інертні субстрати, на які діють білки. Білки складають половину сухої ваги клітинEscherichia coli, тоді як такі молекули як ДНК і РНК — лише 3% і 20%, відповідно.

Каталітична функція. Найбільш важливою функцією білків в організмі є функція каталізу різних хімічних реакцій.

Ферменти— тип білків, що характеризується специфічними каталітичними властивостями, тобто кожний фермент каталізує одну або декілька реакцій. Ферменти каталізують реакції розщеплювання (катаболізм) і синтезу (анаболізм) складних молекул, зокрема, синтез та деградацію ДНК, РНК, білків, ліпідів та цукрів. Крім того вони каталізують синтез та деградацію малих молекул, хімічні модифікації та ряд інших реакцій, необхідних для життєдіяльності. Відомо біля 4 тис. реакцій, що каталізуються ферментами, багато з них протікають поза межами клітин, наприклад ферментпепсинрозщеплює білки в процесі травлення. Прискорення реакції в результаті ферментативного каталізу може проходити в 10¹⁷ разів швидше, ніж без каталізатора. Молекули, які змінюються в результаті реакції при посередництві ферментів, називаються субстратами.

Хоча ферменти зазвичай складаються з сотень амінокислот, тільки невелика частина з них взаємодіє з субстратом, і ще менша кількість — в середньому 3-4 амінокислоти безпосередньо беруть участь в каталізі. Частина ферменту, яка з'єднується із субстратом і містить каталітичні амінокислоти, називається  активним центром ферменту.

Структурна функція. Структурні білки можуть надавати форму та жорсткість клітинам та тканинам є фібрилярними, інші формують за допомогою полімеризаціїглобулбілок за певних умов. Структурну роль всередині клітини мають компонентицитоскелету: наприклад глобулярніактинітубулінв еукаріотів. Інші компоненти цитоскелету ─  фібрилярні білки також мають структурну функцію у забезпеченні структури окремих органів, наприклад, міжклітиннийкератинважливий для підтримки структуриволосся,нігтівіпір'яптахів.Колаген,ламінініеластинважливі для підтримкиепітеліюстінок порожнинних органів —легенів,шлункатощо. Колаген і еластин — основні компонентисполучної тканини(наприклад,хряща).

Захисна функція. Багато білків, що входять до складу крові, беруть участь в захисній відповіді організму як на пошкодження, так і на атакупатогенів. Прикладами першої групи білків служатьфібриногениітромбіни, що беруть участь взгортанні крові, аантитіла(імуноглобуліни), нейтралізують бактерії,вірусиабо чужорідні білки. Антитіла, що входять до складуадаптативної імунної системи, приєднуються до чужорідних для даного організму речовин,антигенів, і таким чином нейтралізують їх, направляючи до місць знищення. Антитіла можутьсекретуватисяв міжклітинний простір або закріплюватися в мембранах спеціалізованихВ-лімфоцитів.

Принципово іншим класом захисних білків (зазвичай пептидів) є токсини, що використовуються багатьма організмами для знищенняхижаківіпаразитів, тоді як власні клітини захищені від токсинів фізичним бар'єром, містятьантидот(протиотруту), що локально нейтралізує токсин, або нечутливі до нього через іншу будову, ніж клітини жертви токсинів.

Захист клітин від токсинів, шкідливих хімічних речовин з навколишнього середовища й продуктів власного метаболізму, а також багатьох фармацевтичних препаратів може здійснюватися мембранними білками-насосами. Різноманітність, специфічність і принцип дії таких білків-насосів, відкачуючих шкідливі речовини із клітин, сильно варіює від організму до організму.

Широко розповсюдженим способом захисту бактерій від  бактеріофагівєсистема рестрикції ─ модифікація.Рестриктазарозщеплює незахищену ДНК бактеріофагів. Існує багато інших способів і відповідних білків для захисту бактерій від фагів і еукаріотичних клітин від ДНК- та РНК-вірусіві бактерій.

Сигнальна та регуляторна функція. Багато білків беруть участь в процесах передачі сигналівна міжклітинному та внутрішньоклітинному рівнях. Деякі білки,гормони,нейротрансмітери,фактори ростуіцитокінипептидної природи — позаклітинні сигнальні молекули, що передають сигнал від клітини, де вони були синтезовані, до інших клітин, як поряд із клітиною (нейротрансмітери, фактори росту), так і у віддаленних тканинах (гормони). До прикладів таких білків належить гормонінсулін, який регулює концентраціюглюкозивкровітафактор некрозу пухлин, що передає сигнали про запалення між клітинами організму.

Інші молекули, залучені до сигнальної системи, — рецептори, що можуть бути якмембранними, так і цитоплазматичними або периплазматичними білками. Одна частина молекули рецептора сприймає сигнал, який за допомогоюконформаційних змінпередається на іншу частину молекули, що активує передачу сигналу на інші клітинні компоненти. У мембранних рецепторів частина молекули, що зв'язується з сигнальною молекулою, знаходиться на поверхні клітини, а домен, що передає сигнал, усередині. Часто рецептори є водночас і мембранними каналами, відповідь яких на зовнішній сигнал полягає в зміні концентрації певного іону в клітині.

Транспортна функція. Розчинні білки, що беруть участь в транспорті малих молекул, зв'язують відповідний субстрат в одній частині клітини або організму, наприклад в місцях високої концентрації або при присутності додаткових регуляторних факторів, і легко вивільняють його в місцях низької концентрації субстрату або там, де відсутні згадані регуляторні молекули. Прикладом таких транспортних білків можна назвати гемоглобін, який переноситькисеньз легень до решти тканин івуглекислий газвід тканин до легень.

Деякі мембранні білкиберуть участь в транспорті малих молекул через біологічні мембрани, змінюючи їхпроникністьдля цих молекул.Ліпіднийкомпонент мембрани водонепроникний (гідрофобний), що запобігаєдифузіїполярних або заряджених (іони) молекул. Ці мембранні білки містять внутрішні канали, які дозволяють таким молекулам переміщатися всередину або назовні, та мають можливість відкривати або закривати їх за певними умовами. Багатоіонних каналівспеціалізується на транспорті тільки одного іона, таккалєвіінатрієві каналирозрізняють ці схожі йони і пропускають тільки один з них (рис. 3.2.).

Рис.3.2. Схематичне зображення іонних каналів в мембрані клітини

Багато інших мембранних білків переносять макромолекули до окремих відділів клітини.

Ще однією життєво важливою білковою транспортною системаю є електронтранспортний ланцюг, необхідний у процесахфотосинтезутаклітинного дихання. В результаті роботи цієї системи, електрони переносяться через мембрану проти електричного поля за рахунок енергії світла абокатаболічноїенергії, що отримується вциклі Кребсата при окисленні білків і ліпідів. Енергія, збережена у формі різниціелектрохімічних потенціалів, використовується іншим білковим комплексом,АТФ-синтазою, для перетворення цієї енергії наАТФ, форму, зручну для використання іншими білками клітини.

Моторна функція. Функцією молекулярних моторівє здійснення механічної роботи в межах клітини за рахунок хімічної або електричної енергії. Такмоторні білки, підгрупа молекулярних моторів, переміщують клітинні «вантажі» уздовж філаментів. Моторні білкидинеїниікінезинитранспортують молекули та органели вподовжмікротрубочокз використаннямгідролізуАТФяк джерела енергії.

Моторні білки часто відповідають і за макроскопічний рух організму. Наприклад, синхронізований рух багатьох молекул білка міозинаприводить до скороченням'язів. Для руху окремих клітин використовуютьсяджгутики,ворсинкита інших відповідних органел клітини.

Запасна (резервна) функція. У деяких системах класифікації виділяється окрема група білків, що виконують, головним чином, резервну і харчову функцію. Проте, майже усі білки використовуються в організмі як джерело амінокислот.

Дуже важливо знати, що повноцінний білок містить у своєму складі усі незамінні амінокислоти. Неповноцінний білок містить у своєму складі не усі незамінні амінокислоти. Кожен білок унікальний за своєю структурою і функціями.

Фізико-хімічні властивості білків

Оптична активність. Кожна амінокислота, крім гліцину, містить один чи більше асиметричних атомів вуглецю, тобто проявляє оптичну активність. За абсолютною конфігурацією амінокислоти в організмі людини належать до L-ряду.

Розчинність білків – велика спорідненість з водою (гідрофільність). Це пов’язано з гідратацією білкової молекули у результаті взаємодії диполів води з йонними (-NН₂ і –СООН) і полярними ( -ОН, -NН, -СО) групами в білковій молекулі. Вода навколо білкової молекули називається структурованою. Заряд білкової молекули та гідратна оболонка навколо білкової молекули надають стабільність розчинам білків. Розчинність білків у воді зростає при додаванні нейтральних солей незначної концентрації. Йони солей взаємодіють з протилежними зарядами білка, екранують заряджені групи білкових молекул і тим самим зменшують білкову взаємодію. Зворотну дію здійснює підвищення концентрації солей.

Амфотерність білкових молекул – здатність проявляти кислий або основний характер.

Ізоелектрична точка білка – значення рН середовища, при якому білок не несе сумарного заряду, тобто число негативних зарядів зрівнюється з числом позитивних зарядів. У кислому середовищі сумарний заряд білкової молекули позитивний, тому вона рухається до катоду (─). У лужному середовищі сумарний заряд білкової молекули негативний, тому вона рухається до аноду(+). При значенні рН, що відповідає ізоелектричній точці, білок не рухається в електричному полі.

Висолювання – процес осадження білків нейтральними солями. При цьому руйнується гідратна оболонка і нейтралізуються заряди білкової молекули. Такі білки зберігають свої природні властивості і функції після видалення солі.

Емульгуючі властивості білка – білок утворює на поверхні крапель жиру (за рахунок гідрофобної взаємодії) тонку плівку, яка притягує воду (за рахунок полярних груп) і протидіє злипанню жирових часток. Казеїн молока емульгує (стабілізує) природну емульсію – молоко.

Денатурація білків – під дією різних фізичних і хімічних факторів порушується природна просторова структура білкової молекули: руйнуються четвертинна, третинна і вторинна структури (первинна не змінюється). Це призводить до зменшення або повної втрати розчинності, специфічної біологічної активності, зміни оптичних властивостей, в’язкості та ін. При денатурації розриваються йонні, водневі і дисульфідні зв’язки, поліпептидний ланцюг розкручується і знаходиться або в розгорнутому стані, або у вигляді хаотичного клубка. Відбувається перебудова структури білкової молекули. Білок втрачає свої нативні властивості і розчинність. Для більшості білків це незворотний процес, але для деяких, наприклад, білків м'язів – зворотний. Денатурації білка в побуті — приготування курячого яйця, коли під впливом високої температури розчинний у воді прозорий білок овальбумінстає щільним, нерозчинним і непрозорим.

Білки, що використовуються в технологічних методах і вимагають нетипових умов, часто підбираються з екстремофілів— організмів, здатних проживати в екстремальних умовах. Так, наприклад,ДНК-полімеразаTaq, що використовується вполімеразній ланцюговій реакції(ПЛР), може витримувати без денатурації багаторазове нагрівання до 95 °C. Вона була спочатку виділена збактеріїThermus aquaticus. Денатурація може бути зворотною, наприклад при висолюванніводорозчинних білків за допомогою солейамонію, що використовується як спосіб очищення білків.

Реакції осадження білків можна розділити на дві групи:

а) практично незворотні реакції осадження, при яких білки зазнають глибокі зміни і не можуть бути знов розчинені в первинному розчиннику: в цьому випадку має місце денатурація білка; до необоротних реакцій відносяться осадження білку солями важких металів, алкалоїдними реактивами, мінеральними, органічними кислотами і осадження при нагріванні;

б) зворотні реакції осадження, при яких білки, не піддаються глибоким змінам і тому можуть бути розчинені в первинному розчиннику; молекули білка при цьому зберігають свої первинні, включаючи біологічні, властивості і не піддається денатурація.

До зворотних реакцій осадження слід віднести реакції осадження білків органічними розчинниками (спиртом або ацетоном) і реакції висолювання білків (осадження під впливом концентрованих розчинів нейтральних солей лужних і лужноземельних матеріалів).

Осадження білків при нагріванні. Випадання білків в осад при нагріванні (звертання) – характерне майже для всіх білків (виключення складає желатина, яка не руйнується при нагріванні). Особливо легко і більш повно відбувається осадження білка в слабокислому середовищі, поблизу від ізоелектричної точки. У нейтральному і сильнокислому середовищах осадження білків йде значно гірше, а в лужному середовищі зовсім не спостерігається. На відміну від осадження солями білків при нагріванні – денатурація білків – незворотна.

Реакція денатурації проходить поступово і прискорюється з підвищенням температури, тому короткочасне нагрівання може і не призвести до коагуляції. Присутність солей і концентрація водневих йонів відіграють важливу роль у випаданні в осад денатурованого при нагріванні білку.

Найбільш повна і швидка коагуляція має місце в ізоелектричній точці білку, тобто при такій величині рН, коли колоїдні частинки білку найменш стійкі.

Деякі білки, що мають в своєму складі багато дисульфідних зв’язків, стійких до високої температури, здатні до ренатурації і не втрачають своєї структури та функціональної активності після припинення дії високої температури (ферменти трипсин та рибонуклеаза).

Осадження білків концентрованими органічними і мінеральними кислотами. При дії на білок концентрованих мінеральних і органічних кислот відбувається денатурація білка внаслідок дегідратації та утворення комплексних солей білка з кислотами. У надлишку всіх мінеральних кислот, крім азотної, осад білка розчиняється. Реакція осадження концентрованою азотною кислотою лежить в основі кількісного визначення білка за методом Робертса-Стольнікова-Брандберга.

Осадження білку концентрованими мінеральними кислотами (окрім ортофосфорної кислоти) пояснюється як явищами дегідратації білкових частинок і нейтралізації їх зарядів, так і з інших причин (денатурацією, утворенням солей).

У надлишку сульфатної або хлоридної кислот, а також при їх тривалій дії, осад денатурованого білку розчиняється, за рахунок перезарядки білку і часткового гідролізу. У надлишку нітратної кислоти цього розчинення не відбувається (супутній нітрат-йон заважає перезарядці білкової молекули).

Механізм осадження білків органічними кислотами пояснюється дегідратацією білкової молекули і зняттям заряду. Осадження трихлороцтовою кислотою надає можливість відокремити білки від пептидів та амінокислот (білковий азот відділяється від небілкового). Відбувається незворотна реакція осадження.

Осадження білків солями важких металів. Солі важких металів (Pb, Cu, Zn, Ni, Cd, Co, Sb, Sn, Bi, Hg та ін.) осаджують білки з розчинів, утворюючи солеподібні і комплексні сполуки, що розчинні у надлишку цих солей, але нерозчинні у воді.

Це пояснюється тим, що надлишок іонів металу, адсорбуючись, спричиняє перезарядку білкового комплексу, внаслідок чого в розчин переходить комплекс зміненого білка з металом. Це явище називається адсорбційною пептизацією.

Властивість білка міцно зв’язувати іони важких металів у вигляді нерозчинного осаду у воді використовується при отруєнні солями ртуті, міді, свинцю тощо. Рекомендують одразу ж після отруєння вживати білки молока або яєць, доки ці солі знаходяться ще в шлунку і не встигли всмоктатись. Після чого у хворого викликають блювоту, щоб вивести отруту.

Кристалізація. Кристали білків та інших макромолекул вирощуються в розчині. Найзагальніший підхід — поступове зниження розчинності його компонентів, молекули  осаджуютьсяз розчину, формуючи аморфнийосадна дні посудини (рис.3.3.).

Рис.3.3. Кристали білків розмірами від 0,1 до 1 мм для кристалографії. Фотографія в поляризованому світлі

Ріст кристалів в розчині характеризується двома стадіями:  нуклеація, тобто утворення мікроскопічного ядра кристалу (що має біля 100 молекул), та росту цього ядра до розмірів, необхідних для рентгеноструктурного аналізу. Зазвичай умови підбираються сприятливими для росту кристалу.

Надзвичайно важко передбачити умови, оптимальні для росту ідеально впорядкованих кристалів. Для кристалізації різних білкових молекул використовуються різні умови: зміна pH, додавання центрів кристалізації, зміну температури для підбору швидкості кристалізації або для створення перенасиченого розчину. Ці методи вимагають великої кількості досліджуваної речовини високого рівня очистки у випадку білків.

Відомо декілька чинників, що перешкоджають кристалізації. Наприклад, кристали тримають при постійній температурі і захищають від вібрацій, які перешкоджали б отриманню якісного кристалу. Домішки в розчині часто заважають кристалізації. Кристали можуть псуватися при сполученні кількох центрів кристалізації.

Висолювання білків. Висолювання – це зворотна реакція осадження білків нейтральними солями лужних та лужноземельних металів різних концентрацій. Реакція висолювання зумовлена дегідратацією макромолекул білка з одночасною нейтралізацією його електричного заряду.

Для висолювання найчастіше застосовуються такі солі: (NH₄)₂SO₄, NаСI, Nа₂SO₄, MgSO₄. Білки, що осаджуються, не зазнають глибоких структурних змін і їх осади можна знову розчинити у вихідному розчиннику, а молекула білка зберігає при цьому свої попередні нативні властивості.

Реакції осадження білків органічними розчинниками (спиртом, ацетоном) за умов нетривалої дії і низької температури можуть також бути зворотними.

Метод висолювання широко використовується для фракціонування суміші білків, коли треба відокремити один білок від іншого (наприклад відділити альбуміни від глобулінів у білку курячого яйця). Грубодисперсні білки ─ глобуліни висолюються значно легше, ніж альбуміни напівнасиченим розчином сірчанокислого амонію, тоді як альбуміни – насиченим розчином.

Розділення альбумінів і глобулінів методом висолювання

Альбуміни і глобуліни є найбільш поширеними в природних об'єктах білками. Звичайно вони зустрічаються разом і відділення їх один від одного основане на різній їх розчинності у воді і різній здатності до висолювання мінеральними солями.

Висолювання це класичний метод розділення альбуміну і глобулінів заснований на осадженні останніх, 2 М сульфатом амонія (50% -ве насичення). Альбумін осідає лише 4 М сульфатом амонія (100% -ве насичення). Замість сульфату амонію можуть бути використані і інші нейтральні солі - сульфат натрію, сульфат магнію, суміші одно- і двохзаміщених фосфатів та ін. Проте найбільше поширення для осадження білків отримав сульфат амонію. Це обумовлено головним чином тим, що його висока розчинність у воді поєднується з її незалежністю від температури. Навпаки, такі осаджувачі, як, сульфат натрію, мають обмежену сферу застосування через низьку розчинність при температурі, близькій до 0°. Сульфат амонію дуже зручний також тим, що не чинить денатуруючої дії на найбільш лабільні з відомих білків.

Висолювання білків є зворотним процесом: після виведення солі шляхом

діалізу або розведенням водою білок знову розчиняється і відновлює свої нативні властивості.

Це можна пояснити наступним чином: у водному розчині молекули білків заряджені і гідратовані. Молекули солей руйнують гідратну оболонку і знімають заряд з білкової молекули шляхом адсорбції на ній йонів солей. Внаслідок цього молекули білків злипаються і випадають в осад. Для різних солей потрібне різне значення рН середовища для висолювання білків. Так, амоній сульфат висолює білки у слабкокислому середовищі.