Лабораторна робота 5

(4 години)

«Дослідження фагоцитарної ланки імунітету (початок). Вивчення кисень залежної бактерицидності фагоцитів в нст-тесті»

Мета роботи: вивчити явище фагоцитозу, навчитися визначати поглинальну та перетравлювальну здатності фагоцитів.

План:

1. Відкриття фагоцитозу І.І. Мечніковим. Основні поняття.

2. Клітинні основи фагоцитозу: полі- та мононуклеарні фагоцити.

3. Класична схема і механізми фагоцитарних реакцій.

4. Хемотаксис.

5. Адгезія фагоцитів до об’єкта фагоцитозу.

6. Активація фагоцитів при адгезії і розпластовуванні.

7. Занурення частинки.

8. Формування фаголізосоми.

9. Лізис і розщеплення фагоцитованих часточок.

Матеріали та обладнання: кров людини чи лабораторних тварин (гепаринізована), добова агарова культура E. coli (5×10⁸ кл/мл), добова агарова культура E. coli знешкоджена нагріванням (10⁹ кл/мл), 2% розчин натрію лимоннокислого, гепарин, 0,1% розчин нітросинього тетразолію, 5% розчин формаліну, 0,9%-ий розчин NaCl, середовище 199, фарба Мая-Грюнвальда, скляні пробірки об’ємом 1 – 2 см³, знежирені предметні скельця, термостат, центрифуга лабораторна (до 3000 об/хв), центрифужні пробірки, зрівноважувачі для пробірок, пастерки, гумові груші №1, самплери на 0,1 мл та наконечники до них.

Самостійна робота студентів:

Завдання №1. Вивчення поглинальної здатності фагоцитів.

1. До пробірки з антикоагулянтом (0,2 мл 2% розчину натрію лимоннокислого або 0,2 мл гепарину в концентрації 50 од/мл) вносять 0,1 мл крові, ретельно перемішують.

2. Додають 0,05 мл зависини тест-мікробної культури. Як тест-мікроб використовують добову агарову культуру Е. соlі (або іншу придатну мікробну культуру) у фізіологічному розчині в концентрації 500 млн мікробних тіл в 1 мл (5×10⁸ кл/мл).

3. Витримують у термостаті за 37°С упродовж 30 хв.

4. Центрифугують при 2000 – 3000 об/хв 15 хв до розшарування рідини на верхній (плазма), нижній (еритроцити) та середній (лейкоцити) шари.

5. Пастерівською піпеткою відсмоктують середній шар і роблять мазок.

6. Мазок підсушують на повітрі 2 – 3 год.

7. Фіксують фарбою-фіксатором Мая-Грюнвальда упродовж 2 – 3 хв. Фарбу змивають дистильованою водою, мазки підсушують на повітрі та залишають до наступного заняття.

Завдання №2. Вивчення перетравлювальної здатності фагоцитів.

1. До пробірок №1 та №2 вносять 0,2 мл антикоагулянту(0,2 мл 2% розчину натрію лимоннокислого або 0,2 мл гепарину в концентрації 50 од/мл).

2. До пробірки №1 з антикоагулянтом вносять 0,1 мл крові, 0,2 мл середовища 199 і 0,1 мл 0,1% розчину нітросинього тетразолію (спонтанний НСТ-тест).

3. До пробірки №2 з антикоагулянтом вносять 0,1 мл крові, 0,2 мл середовища 199 і 0,1 мл 0,1 зависини E. coli знешкодженої нагріванням (1 млрд кл/мл) (стимульований НСТ-тест).

4. Проби ретельно перемішують.

5. Проби інкубують у термостаті за 37ºС упродовж 30 хв.

6. Після закінчення інкубування до пробірки №1 додають 3,0 мл дистильованої води для гемолізу еритроцитів. Добре перемішують.

7. Після закінчення інкубування до пробірки №2 додають 0,2 мл 5% розчину формаліну. Ретельно перемішують. Пробу залишають на 10 – 15 хв за кімнатної температури. Через 15 хв додають 3,0 мл дистильованої води. Пробу добре струшують.

8. Проби центрифугують при 1500 об/хв упродовж 5 – 7 хв.

9. Надосадову рідину зливають, до осаду додають 0,1 мл фіз. розчину і вміст пробірки виливають на знежирене предметне скло.

10. Мазок підсушують на повітрі і залишають до наступного заняття.

11. Оформити протокол заняття, зробити висновки.