Контрольні запитання:
Які клітини крові належать до фагоцитувальних клітин?
Які Вам відомі механізми оксигензалежного та оксигеннезалежного знищення мікроорганізмів?
Охарактеризуйте основні етапи фагоцитозу.
Для яких імунологічних досліджень використовується НСТ-тест?
Література:
1. Вершигора А.Ю., Пастер Є.У., Колибо Д.В., Позур В.К., Віхоть М.Є, Михальський Л.О., Швець Ю.В., Холодна Л.С., Моложава О.С. Імунологія. – К.: Вища шк., 2005. – 599 с.
2. Ярилин А.А. Основы иммунологии. – М.: Медицина, 1999. – 608 с.
3. Маянский А.Н. Лекции по иммунологии. – Нижний Новгород: изд-во Нижегородской государственной медицинской академии, 2003. – 272 с.
4. Беркало Л.В., Бобович О.В., Боброва Н.О. та ін. Методи клінічних та експериментальних досліджень в медицині. – Полтава: Полімет, 2003. – С.66 – 68.
5. К.Г.Гаркава. Методи імунологічних досліджень: Конспект лекцій для студ. напряму підготовки 0929 «Біотехнологія» денної та заочної форми навчання. – К.: НУХТ, 2009. – 53 с. (Шифр 7363).
Лабораторна робота 6
(4 години)
«Дослідження фагоцитарної ланки імунітету (закінчення). Вивчення поглинальної здатності фагоцитів»
Мета роботи: вивчити явище фагоцитозу, визначити активності нейтрофільних гранулоцитів (закінчення).
План:
1. Поняття про комплімент
2. Шляхи активації комплементу: класичний та альтернативний.
3. Біологічна активність комплементу.
4. Фагоцити і комплімент.
5. Поняття про імунну відповідь.
6. Етапи розвитку імунної відповіді організму.
7. Первинна та вторинна імунна відповідь.
8. Взаємодія клітин при імунній відповіді.
9. Участь фагоцитів в імунній відповіді.
Матеріали та обладнання: мазки виготовлені під час виконання лабораторної роботи №5, етиловий спирт, метанол, 0,1%-ий спиртовий розчин нейтрального червоного барвника на ацетатному буфері, фарба Романовського-Гімзе, фарба Мая-Грюнвальда, світловий мікроскоп, імерсійне масло.
Самостійна робота студентів:
Завдання №1. Вивчення поглинальної здатності фагоцитів.
1. Одержані мазки дофарбувати фарбою Романовського-Гімзе упродовж 17 хв. Фарбу змити дистильованою водою, мазки підсушували на повітрі.
2. Облік отриманих результатів провести під світловим мікроскопом з використанням імерсійного об’єктиву ×90 і визначити 2 показники: відсоток фагоцитозу (ВФ), тобто відсоток фагоцитувальних клітин (підраховують 100 клітин нейтрофільних лейкоцитів), які поглинули мікробні частки, та фагоцитарне число (ФЧ) за формулою 5.1 (підрахунок проводять на 100 нейтрофілів).
,
у.о.
, де:
a – кількість клітин, які поглинули 5 – 9 бактеріальних клітин;
b – кількість клітин, які містять 10 – 14 клітин;
c – кількість клітин, в яких кількість бактерій 15 і більше.
Відсоток фагоцитувальних нейтрофілів у здорових людей складає від 47% до 72%, а фагоцитарне число – від 12 до 23.
Завдання №2. Вивчення перетравлювальної здатності фагоцитів.
Провести фарбування мазків (лаб. роб. №5): зафіксувати клітини метанолом 1 – 2 хв, нанести 0,1-ий % спиртовий розчин нейтрального червоного індикатора на 20 – 30 хв, змити фарбу дист. водою, підсушити мазок на повітрі.
Облік отриманих результатів провести під світловим мікроскопом з використанням імерсійного об’єктиву ×90 і визначити 2 показники: вміст НСТ-позитивних нейтрофілів (з розрахунку на 100 клітин) та розрахувати середній цитохімічний коефіцієнт за формулою 5.2. В полі зору мікроскопа підрахувати 100 –200 клітин нейтрофільних лейкоцитів і визначити відсоток нейтрофілів, які містять в цитоплазмі темпі зерна диформазану та кількість утворених гранул за цитохімічним коефіцієнтом (для спонтанного НСТ-тесту та для стимульованого НСТ-тесту).
3. Оцiнку цитохiмiчної реакції провести загальноприйнятим напiвкiлькiсним методом з визначенням ступеня (0 – 4) забарвлення площі клітин i підрахуванням середнього цитохiмiчного коефiцiєнту (ЦХК).
Реакцію оцінюють за чотирма ступенями в залежності від кількості гранул, що утворились в нейтрофілах: I ступінь – одиничні гранули, II ступінь – гранули займають 1/3 цитоплазми клітини, III ступінь – гранули займають 2/3 цитоплазми клітини, IV ступінь – гранули займають всю цитоплазму клітини. Розрахунок проводять за формулою 5.2:
,
у.о.
де:
an+ – кількість клітин, в яких гранули диформазану займають до 25%
цитоплазми;
bn++ – кількість клітин,в яких гранули диформазану займають 25 – 50 %
цитоплазми;
cn+++ – кількість клітин, в яких 55 – 75% цитоплазми покрито гранулами
диформазану;
dn++++ – кількість клітин, в яких гранули покривають більше 75 % цитоплазми та ядро.
Приклад розрахунку. Відсоток нейтрофілів, що мають у цитоплазмі гранули, дорівнював 10. З них 5 клітин – I ступеня, 7 клітини – II ступеня, 4 клітини – III ступеня формування гранул. Цитохімічний коефіцієнт становить:
ЦХК дорівнює 0,31 у.о. Можна зробити висновок про добре виражену активізацію фагогоцитарної системи, що характерно для нормальної реакції. При ряді патологічних процесів відновлення нітросинього тетразолію в клітинах знижено і, що особливо важливо, немає активізації цих процесів під впливом стимулювальних агентів.
4. Оформити протокол заняття, зробити висновки.