48

Вихідна

культура дріжджів,

5·106

кл./мл

3 мл

3 мл

3 мл

0,1 мл

0,1 мл

0,1 мл

0,1 мл

УФ 4,9 мл води

0,1 мл

0,9 мл води

0,1 мл

0,1 мл

2,4 мл 0,1 мл

УФ

води

0,4 мл

0,9 мл води

0,1 мл

0,1 мл

0,1 мл

1,6 мл

води

УФ

0,9 мл води

0,2 мл

0,1 мл

0,1 мл

0,8 мл

води

Рис. 4.1. Схема оброблення клітинної суспензії дріжджів УФ-променями

49

0,1 мл суспензії й переносять в 0,1 мл води (розведення ІІ). У такий спосіб аналізують кожну дозу опромінення. Другий варіант. Після відбору проби із суспензії, опроміненої мінімальною дозою, чашку знову поміщають під випромінювач, і експозиція щораз подовжується відповідно на 600 ерг/мм2∙с). Сумарно клітини отримають дозу 2400 ерг/мм2. Відбір проб для аналізу на ефективність дії УФ-променів здійснюють за послідовністю наведеною в табл.

4.1.

Всі засіяні чашки загортають у папір і вміщують у термостат з температурою 30 °С на 6 – 7 діб, після чого обліковують результати, які після статистичного опрацювання заносять у табл. 4.2.

II. Хімічні фактори, що викликають мутагенез. Для виявлення ефекту дії хімічних мутагенів використовують азотисту кислота або натрієву сіль азотистої кислоти (рис. 4.2).

1.Суспензію клітин з концентрацією 1∙107 клітин/мл дістають змивом культури з поверхні агару 8 мл ацетатного буфера рН 4,4 (титр визначають у камері Горяєва й доводять об'єм до необхідного рівня ацетатним буфером). У пробірку відбирають 3,4 мл суспензії. Із цього об'єму відбирають ще 0,5 мл суспензії. Проводять розведення І і ІІ як зазначено вище, використовуючи замість води фосфатний буфер.

2.Суспензія, що висівається на контрольні чашки, має бути концентрацєю близько 1∙104 клітин/мл. На чашки висівають по 0,05 мл суспензії з кожного розведення на повне середовище. Чашки вміщують у термостат з температурою

30 °С.

3.Для оброблення нітритом натрію до залишеної в пробірці 2,9 мл суспензії додають 0,1 мл свіжоприготовленого 0,5 М розчину нітриту натрію; при цьому кінцева концентрація мутагену становитиме 0,017 М.

З метою досягнення ефекту мутагенної дії суспензію клітин витримують 15, 30 і 45 хв, що дає приблизно 50, 10 і 1 % виживаності. Дію мутагену знімають зміною рН суспензії до 7,0 десятикратним розведенням суспензії фосфатним буфером. Після закінчення першої експозиції відбирають піпеткою 0,1 мл суспензії й переносять у пробірку з 0,9 мл фосфатного буфера. Через 15 хв, а потім ще раз через 15 хв відбирають у такий же спосіб дві проби, дози для яких

дорівнюватимуть відповідно 30 і 45 хв. Концентрація клітин у кожній з відібраних проб без урахування летального ефекту становитиме 106 клітин/мл.

4.Розрахунок розведень отриманих суспензій для висіву на чашки з повним середовищем проводять аналогічно рекомендаціям для дослідів з УФопроміненням. Під час обліку ауксотрофності або при морфологічних мутаціях необхідний висів великої кількості чашок. Кількість суспензії, що її відбирають під час останній експозиції, має бути збільшена до 0,3 мл, об’єм фосфатного буфера для розведення – до 2,7 мл. Кінцевий об'єм суспензії – 3 мл – висівають безпосередньо на чашки. Засіяні чашки вміщують у термостат з температурою 30 °С. Результати підраховують через 6 – 7 діб вирощування.

III. Статистичне опрацювання результатів індукованого мутагенезу.

Для статистичного опрацювання результатів, отриманих під час опромінювання

чи дії мутагенів, досліди необхідно кілька разів повторити.