0,5 мл	0,5			0,5		0,5		0,5		0,5		0,5

Вихідна

культура

E. coli, 2·109

кл./мл

Фосфатний буфер, 4,5 мл

10 × 0,1 мл

ПС по 2 мл,

інкубація 37° С,

18-24 год

ПА +

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

2×0,1

2×0,1

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

2×0,1

2×0,1

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

2×0,1

2×0,1

61

2×0,1 мл

2×0,1 мл

1 мл

10 мл

ПА
ПА	ПА + стрептоміцин

ПА

Фосфатний буфер, 4,5 мл × 6× 3

Рис.6.1. Схема постановки флуктуаційного тесту Лурія й Дельбрюка (ПА – повне агаризоване середовище)

62

пробірки вміщують у термостат з температурою 37 °С на 18 – 24 год. Для визначення концентрації життєздатних клітин у вихідній культурі (і, отже, для визначення кількості клітин, засіяних у незалежні культури) з шостого й сьомого розведень вихідної суспензії висівають три проби по 0,1 мл на дві чашки з ПА (всього шість чашок). Засіяні чашки розміщують у термостаті з температурою 37 °С на 24 год.

3.Із пробірок, засіяних з останнього розведення вихідної культури, проводять висів на повне агаризоване середовище зі стрептоміцином для визначення вмісту стійких до антибіотика клітин. Культури в перших десяти пробірках приймають за незалежні, в одинадцятій – за окрему. З незалежних культур висівають по одній пробі по 0,1 мл (всього десять чашок повного агаризованого середовища зі стрептоміцином). З одинадцятої пробірки висівають десять проб по 0,1 мл на десять чашок з ПА зі стрептоміцином. Кожну пробу по 0,1 мл відбирають окремою мікропіпеткою з максимальною точністю й розтирають на селективному середовищі окремим шпателем.

4.Слід ще визначити концентрацію життєздатних клітин у незалежних культурах. З цією метою проводять серійні розведення (до 10–7) із трьох довільно вибраних незалежних культур. Передбачається, що у всіх незалежних культурах за час інкубації виростає приблизно однакова кількість клітин. З п’ятого й шостого розведень кожної серії висівають по дві проби пo 0,1 мл на чашки з повним агаризованим середовищем (усього 12 чашок). Чашки інкубують при температурі 37 °С протягом 24 год, чашки з повним агаризованим середовищем і стрептоміцином – 48 годин.

Опрацювання результатів

1. Після пророщення культури в чашках Петрі проводять підрахунок вирослих колоній для визначення титру вихідної культури, і результати заносять у табл. 6.1.

	Концентрація клітин у вихідній і незалежній культурах					Таблиця 6.1
Розве-	Вихідна культура			Незалежна культура
	Кількість	Концентра-	Номер	Розве-	Кількість		Концен-
дення	колоній у						трація
	чашках	ція клітин	пробірки	дення	колоній		клітин

2. Для визначення титрів незалежних культур і кількості стрептоміцинстійких клітин у пробах з незалежних і окремих культур рахують колонії, що виросли на чашках з повним агаризованим середовищем і на чашках з повним агаризованим середовищем і стрептоміцином. Результати підрахунку кількості життєздатних клітин у культурах вносять у табл. 6.2.

				63
				Таблиця 6.2
		Аналіз стрептоміцинстійких клітин
		Кількість стійких до		Кількість стійких до
	Номер		Номер	стрептоміцину клітин у
		стрептоміцину клітин у
	проби		культури	пробах з незалежних
		пробах з окремої культури
				культур

3.Дані про кількість стійких до стрептоміцину клітин у пробах з різних культур опрацьовують статистично: обчислюють середні арифметичні й дисперсію кількості стійких до стрептоміцину клітин для проб з десяти незалежних культур і для десяти проб з окремої культури.

4.Порівнюють дисперсії кількості стійких клітин для незалежних культур і для проб з окремої культури. Далі дають відповідь на запитання, у якому випадку флуктуації між пробами можна віднести до погрішності експерименту, а в якому

–до розходжень у часі виникнення мутантів у пробах. На підставі отриманих результатів роблять висновок щодо природи виникнення ознаки стійкості до стрептоміцину.

5.За допомогою формули Лурія–Дельбрюка обчислюють частоту виникнення мутацій стрептоміцинстійкості у штама E. coli К12.

Контрольні запитання

1.Які ви знаєте гіпотези виникнення стійкості мікроорганізмів до різних негативних факторів навколишнього середовища?

2.У чому полягає суть флуктуаційного тесту Лурія і Дельбрюка?

3.Як оцінюється тест статистично?

4.Які фактори необхідно враховувати під час постановки флуктуаційного тесту?

5.Як використовують флуктуаційний тест?

Література: [2, 3, 6, 9].

64

ЛАБОРАТОРНЕ ЗАНЯТТЯ 7 ГЕНЕТИЧНЕ КАРТУВАННЯ ПРОКАРІОТ

Мета: вивчення кон'югації як основи для розроблення ряду методик генетичного аналізу: визначення частот рекомбінацій між генетичними маркерами, послідовності генетичних детермінант на хромосомі за градієнтом їхньої передачі рекомбінатам, встановлення локалізації генетичних маркерів за часом їхнього проникнення в реципієнтну клітину – картування методом переривання кон'югації; опанування названих методик.

Обладнання та матеріали: центрифуга з обертовою частотою 6000 об/хв; термостатована качалка; термостат; буфер; чашки Петрі з повним агаризованим середовищем; пробірки 22×200 мм з 2 мл повного середовища; пробірки з 4,5 мл повним середовищем; чашки Петрі з повним агаризованим середовищем, мінімальним середовищем, селективними середовищами SB,TH; SB,PH; SB,TP зі стрептоміцином, тіаміном, проліном, триптофаном і гістидином; колби Ерленмейєра на 50 мл; пробірки для розведень; стерильні піпетки; штами бактерій

Hfr та F– E. coli К12.

Загальні відомості Кон'югація – це процес міжклітинного контакту, в якому ДНК передається

від чоловічої бактерійної клітини (донора) до жіночої (реципієнта). Кон'югація, зумовлена статевим F фактором (особоливою епісомою), полягає в здійсненні контакту між клітинами штаму E. coli , що розрізняються за статтю (донор і реципієнт). Цей процес може супроводжуватися переданням бактеріальної хромосоми й утворенням генетичних рекомбінатів.

Перенесення хромосоми від донора до реципієнта характеризується:

•суворою орієнтованістю, зв'язаною зі структурою бактеріальної хромосоми, лінійністю перенесеної хромосоми й наявністю специфічного локусу О, інтегрованого до хромосоми статевого фактора;

•сталістю швидкості перенесення генетичних детермінантів при схрещуванні;

•частковістю у зв’язку із спонтанним розривом хромосоми, що пов'язано зі збільшенням відстані від початкової точки О.

Однак будь-який генетичний маркер донора має рівні можливості для інтеграції в хромосому реципієнта. Внаслідок цього по довжині хромосоми утворюється безперервний градієнт передання рекомбінантам спадкоємних ознак донора, що відображає градієнт перенесення відповідних генетичних детермінантів (рис. 7.1.).

Кон'югація послужила основою для розроблення ряду методик генетичного аналізу:

•визначення частот рекомбінацій між генетичними маркерами; але через ряд генетичних особливостей цей метод не придатний для картування довгих сегментів, але досить ефективний при аналізі тісно зчеплених локусів і при внутрішньогенному картуванні (маркери відстоять один від одного не далі 2 хв);

65

•визначення послідовності генетичних детермінант у хромосомі за градієнтом їхнього передання рекомбінатам;

•локалізації генетичних маркерів за часом їхнього проникнення в реципієнтну клітину – картування методом переривання кон'югації.

Рис. 7.1. Генетична карта E. coli

Результати, одержані двома останніми методами, визначаються особливостями перенесення і не являють собою функцію частот рекомбінації. Ці методи використовують для картування довгих фрагментів хромосом, тобто під час аналізу маркерів, що відстоять один від одного на відстані більше двох хвилин переносу.

Рекомбінанти можна, у свою чергу, визначати двома способами:

•Висів з кон’югаційної суміші на селективне середовище для відбору рекомбінантів за одним, найближчому до початкової точки О хромосоми, маркером донора (селективний маркер). Кількість рекомбінантів, що успадкували неселективний маркер, виражається у відсотках від загального числа рекомбінантів за проксимальним маркером.

66

•Проби з кон’югаційної суміші відразу розсівають на різні селективні середовища. Кількість рекомбінантів за кожним маркером донора виражається у відсотках від числа клітин штаму Hfr у кон’югаційній суміші.

Процес кон’югації у бактерій Escherihia coli був відкритий у 1946 р. Дж. Ледербергом і Е. Тейтумом. У бактерій E. coli клітина-донор (чоловіча клітина) має продовгувату форму, а клітина-реципієнт (жіноча клітина) – заокруглену. Клітина-донор утворює статеві ворсинки (пілі), які притягують її до клітиниреципієнта і створюють цитоплазматичний канал, через який ДНК із клітинидонора переходить у клітину-реципієнт.

Існує три типи клітин-донорів: F+ (еф–плюс), Hfr (ейч–еф–а) и F′ (еф– прім). Клітини F+ мають у цитоплазмі статевий фактор – специфічну F-плазміду (фактор фертильності, фактор переносу або F-фактор). Клітини Hfr – мають інтегровану у бактеріальну хромосому F-плазміду. F′-клітини мають F-плазміду, яка містить частину хромосомних генів.

Клітина-реципієнт не містить F-плазміди і її позначають як F–-клітина. F– плазміда має довжину біля 100 т.п.н. На даний момент вивчено більше 60 генів F– плазміди, зокрема таких, які відповідають за її автономну реплікацію (гени rep), здатність забезпечувати перенесення генетичного матеріалу в процесі кон’югації (гени rep), несумісність з іншими плазмідами (гени inc) та ін.

Одна із основних властивостей F-плазміди полягає у тому, що вона забезпечує бактеріальні клітини здатністю бути донорами генетичного матеріалу (кон’югативність), тобто можливість вступати у кон’югацію з безплазмідними (реципієнтними) клітинами і передавати їм певну генетичну інформацію. Ця властивість F-плазміди детермінується генетичною областю tra (від англійського transfer – перенесення), яка містить більше 20 tra-генів. В залежності від контролюємих ними функцій tra-гени F-плазміди класифікують на кілька груп.

Гени однієї tra-групи кодують білки, що необхідні для синтезу на поверхні клітини E.coli специфічних ниткоподібних структур – статевих пілей (1 – 3 пілі на клітину). Статеві пілі забезпечують формування первинного кон’югаційного контакта клітини-донора і клітини-реципієнта.

Інші гени tra-області детермінують синтез білків, що забезпечують метаболізм самого процесу кон’югації і переносуДНК. До них відносяться ферменти ендонуклеази, які розрізають кільцеву молекулу плазмідної ДНК, перетворюючи її у лінійну структуру, що є обов’язковою умовою для перенесення такої молекули із клітини-донора до реципієнтної клітини.

Завдання на виконання

1. Визначаючи порядок розташування локусів pro, trp, his у хромосомі E. coli К12 за градієнтом їхньої передачі рекомбінантам, батьківські штами попередньо пересівають із розсівів на чашках з повним агаризованим середовищем в пробірки 22x200 мм з 2 мл повного середовища (рис. 7.1). Бажано, щоб концентрація бактерій в інокуляті була близька до 105 клітин/мл. Пробірки розміщують на ніч у термостаті з температурою 37 °С. Перед використанням у дослідах нічні культури підрощують у свіжому повному середовищі, для чого