50

			Розрахунок розведень вихідної суспензії клітин S. cerevisiae 15В-П4						Таблиця 4.1
		після опромінення різними дозами УФ-променів (концентрація суспензії 5×106 клітин/мл)
			Передба-	Густота висіву суспензії		Розведення вихідної		Рекомендовані розведення
	Доза			на чашки, клітин/мл		суспензії
№			чуване
	опромінення,
				Для обліку	Для обліку	Для обліку	Для обліку		Для обліку
п/п	2		виживання,		частоти		частоти	Для обліку виживання	частоти
	ерг/мм		%	виживання		виживання
					мутацій		мутацій		мутацій
								4,9 мл води + 0,1 мл
1	Контроль		100	104	105	у 500 разів	у 50 разів	суспензії (р. І)	Висів з
								0,9 мл води + 0,1 мл	р. І і р. ІІ
								з р. І (р. ІІ)
								2,4 мл води + 0,1 мл
2	1200		50	2·104	2·105	у 250 разів	у 25 разів	суспензії (р. І)	Висів з
								0,9 мл води + 0,1 мл	р. І і р. ІІ
								з р.І (р. ІІ)
								1,6 мл води + 0,4 мл
3	1800		10	105	105	у 50 разів	у 5 разів	суспензії (р. І)	Висів з
								0,9 мл води + 0,1 мл	р. І і р. ІІ
								з р. І (р. ІІ)
							Без роз-		Висів без
				106	2·106		ведення по	0,8 мл води + 0,2 мл
4	2400		1			у 5 разів			розведення
							0,1 мл на	суспензії (р. І)	і з р. І
							чашку

51

Вихідна

3,4 мл 0,5 мл

КОНТРОЛЬ

культура

дріжджів,

107

0,5 мл

клітин/мл

2,9 мл

4,5 мл ф. б. 0,1 мл

0,1 мл

0,1 мл 0,5 М NaNO2

4,5 мл ф. б.

0,1 мл

ДОСЛІДИ

Витримка

0,1 мл

0,1 мл

15 хв.

0,9 мл ф. б.

0,1 мл

2,9 мл

0,1 мл 0,5 М NaNO2

0,1 мл

0,9 мл ф. б.

0,1 мл

0,9 мл ф. б.

Витримка

0,1 мл

30 хв.

0,1 мл

0,1 мл

0,1 мл 0,5 М NaNO2

2,9 мл

0,9 мл ф. б.

0,1 мл

0,9 мл ф. б.

Витримка

45 хв.

0,1 мл

0,9 мл ф. б.

Рис.4.2. Схема оброблення клітинної суспензії дріжджів нітритом натрію (ф.б. – фосфатний буфер)

52

З кожного варіанта дослідів відбирають чашки з типовими колоніями для контролю і для кожної дози мутагену й підраховують кількість вирослих колоній (сумарно).

Обчислюють відсоток виживаності в кожній дозі мутагену для даного досліду з огляду на вихідні розведення для висівів; виживаність у контролі приймають за 100 %.

Опрацювання результатів

1. Позначимо число колоній, що виросли на трьох чашках у контролі, N, а число колоній, що виросли на трьох чашках при даній дозі – n. Для контрольних чашок здійснюють розведення вихідної суспензії в 500 разів, а опроміненої суспензії – лише в 250 разів, тобто кількість клітин, що потрапили на кожну чашку після опромінення, буде в два рази більшою. Позначимо коефіцієнт розведення контролю буквою k. Прийнявши виживаність клітин за 100 %, отримаємо виживаність при тій або іншій дозі:

		n
				100			= 100n , %
S =		k
					N
або для першої дози:								kN
			n
					100			50n , %
S1 =			2				=
					N
								N

Аналогічно розраховуємо виживаність і для інших доз мутагену.

Отримані дані щодо виживання клітин заносять у табл. 4.2 з урахуванням доз і кількості повторених дослідів, попередньо прологарифмувавши кожну величину виживаності:

xi = lg Si .

Обчислюють середнє значення виживаності для кожної дози за формулою:

			x =	∑xi	,	(1)
				n
								Таблиця 4.2
	Виживаність клітин дріжджів, оброблених мутагеном
		Виживання опромінених клітин у						Середнє
№	Доза опромінення, с		різних повторах, %					значення
п/п	(доза мутагену, хв)	І	ІІ		ІІІ	IV	V	логарифма
								виживання

160(15)

290(30)

3120(46)

Розраховують середнє квадратичне відхилення σ, погрішність середнього арифметичного mx за формулами:

								53
mx =	σ			;	(2)	σ =	∑(x −xi )2	. (3)
							n −1
		n
								довірчі mxt 95%
Користуючись таблицею					Стьюдента,	визначають

інтервали середніх значень, враховуючи, що при р повторних дослідах число ступеней свободи дорівнює р–1.

2.На міліметровому папері побудувати графік залежності виживаності опромінених клітин від дози УФ-променів або азотистої кислоти. На осі абсцис відкладають значення використаних у досліді доз мутагенів (в ергах на квадратний міліметр або в секундах), а по осі ординат – середні логарифми виживаності. На графіку вгору й униз від крапок, що відповідають середнім значенням виживаності для кожної із доз, відкладають довірчі інтервали, що показують розмах варіювання результатів у повторних дослідах.

3.Уважно розглянути вирослі на чашках колонії. Позначити тушшю всі мутантні клони, підрахувати їхню кількість і занести дані у табл. 4.3.

Таблиця 4.3

Частота аденозин-залежних мутацій у дріжджів S. cerevisiae 15В-ПЧ

		Кількість	Середня	Загальна	Кількість	Частота
	Доза		кількість	кількість		мутацій
		переглянутих			мутантних
	мутагену		колоній на	переглянутих		аденозин-
		чашок			клонів
			чашці	клонів		залежності
	Контроль
	І
	ІІ
	ІІІ

Середню кількість колоній на чашці визначають підрахунком колоній на чашках, засіяних для обліку виживаності. Частоту індукованих мутацій для кожної дози визначають за формулою:

C = MN ,

де М – кількість мутантних клонів; N – кількість колоній на переглянутих чашках. Частота появи спонтанних аденозинзалежних мутантів при такій вибірці

близька до нуля.

Всі дані з частоти індукованих мутацій за винятком спонтанного фону зводять у таблицю за повторними дослідами, як це було зроблено під час обліку виживаності. Розраховують середнє значення частот мутацій та їхні довірчі інтервали за формулами (2) і (3). Середню частоту індукованих мутацій обчислюють за формулою:

xc = ∑nxi ,

де xi значення частот мутацій, отримані в різних повторностях досліду для даної дози; n – кількість повторених дослідів.