Генодиагностика бактериальных менингитов и генотипирование их возбудителей. Пособие для врачей

Автор: д.б.н. А.Е.Платонов, Г.А.Шипулин, Е.Н.Тютюнник, О.В.Платонова  Организация: ФГУН «Центральный НИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора, г. Москва  Утвержден: Председателем секции по эпидемиологии, инфекционным болезням и вирусологии Ученого Совета Минздрава России акад. РАМН Покровским В.И.  Дата утверждения: 2 марта 2001 г.

АННОТАЦИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ГЕНОДИАГНОСТИКА

Общие сведения и принципы  Материально-техническое обеспечение метода  Организация работы ПЦР-лаборатории  Взятие и хранение образцов биологического материала  Выделение ДНК  Праймеры и процедуры амплификации 

Условия амплификации для определения родовой принадлежности возбудителя  Условия амплификации для определения серогрупповой принадлежности менингококков 

Анализ и учет результатов  Метрологические понятия и терминология  Результаты испытаний предлагаемых методик 

Испытания в модельных экспериментах на бактериальные штаммах  Испытания с использованием клинических образцов спинномозговой жидкости: определение родовой принадлежности возбудителей ГБМ  Определение серогруппы менингококка, вызвавшего ГБМ 

Ожидаемый эффект от внедрения метода 

ГЕНОТИПИРОВАНИЕ

Задачи  Классические серологические методы типирования  Генотипирование по одному гену  Генотипирование по всему геному  Мультилокусное секвенирование-типирование (МЛСТ)  Целевое типирование по нескольким генам  Применение генотипирования для характеристики менингококков в Москве  Ожидаемый эффект от внедрения метода 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ЛИТЕРАТУРА

 

АННОТАЦИЯ

В пособии рассматриваются современные методы диагностики гнойных бактериальных менингитов и типирования их возбудителей, основанные на применении полимеразной цепной реакции для многократной амплификации генетического материала бактерий, содержащегося в исследуемом образце, и последующей его идентификации и классификации.

Пособие адресовано врачам лечебно-профилактических учреждений, врачам-инфекционистам, микробиологам и эпидемиологам.

Пособие подготовлено сотрудниками Центрального Научно-исследовательского института эпидемиологии МЗ РФ:

д.б.н. А.Е.Платоновым, Г.А.Шипулиным, Е.Н.Тютюнник, О.В.Платоновой. 

Введение

Современные методы генодиагностики гнойных бактериальных менингитов (ГБМ) основаны на применении полимеразной цепной реакции (ПЦР). Принцип ПЦР заключается в многократной амплификации генетического материала, содержащегося в исследуемом образце, с помощью фермента термостабильной ДНК-полимеразы. При генодиагностике ГБМ в качестве образца используются исходно стерильные жидкости организма человека, в первую очередь, спинномозговая жидкость (СМЖ). Размножению и идентификации подвергают фрагменты генома возбудителей ГБМ, то есть менингококков, пневмококков, гемофильной палочки.

Генотипирование предполагает более детальную характеристику амплифицированных участков генома с помощью ряда методик.

По сравнению с традиционными методами диагностики, генодиагностика с использованием амплификационных технологий отличается высокой чувствительностью и позволяет использовать для диагностики образцы, в которых не содержится живых возбудителей, но только фрагменты их генетического материала.

Результаты генотипирования характеризуются большей однозначностью по сравнению с морфологическими, биохимическими или иммунологическими методами классификации микроорганизмов и предоставляют непосредственную информацию для выяснения эволюционных и эпидемиологических связей различных изолятов бактерий.

Гнойные бактериальные менингиты (ГБМ) – группа тяжело протекающих инфекционных заболеваний, характеризующихся повсеместной распространенностью. Заболеваемость менингококковой инфекцией и другими видами ГБМ в России превышает 5000 случаев в год при летальности от 5 до 20%. Основными возбудителями ГБМ являются бактерии видов Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae. Относительный вклад того или иного вида бактерий в заболеваемость ГБМ зависит от многих факторов: эпидемической обстановки, региона, возрастной группы больных и др. В ходе многолетних (1980-2000 гг.) исследований ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ было установлено, что около 65% случаев ГБМ в Москве были менингококковой этиологии (N.meningitidis), 20% - пневмококковой этиологии (S.pneumoniae), 10% случаев были вызваны гемофильной палочкой типа b (Haemophilus influenzae типа b или Hib) и 5% - прочими бактериями.

Клиника и лечение ГБМ, а также профилактические и противоэпидемические мероприятия подробно описаны в методических документах и приказах Министерства здравоохранения РФ [Приказ № 375 от 23.12.1998 "О мерах по усилению эпидемологического надзора и профилактики менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов"], а также в ряде монографий и учебников [Покровский 1976, Черкасский 1993, Медицинская микробиология 1998]. В этих же документах достаточно полно рассмотрены классические микробиологические методы диагностики ГБМ, такие как метод культивирования микроорганизмов из образца СМЖ и другие. Поэтому обсуждение вопросов, выходящих за рамки собственно генодиагностики и генотипирования будут в данном кратком пособии минимальным.

Большинство лечебных учреждений России, в которые госпитализируются больные ГБМ, располагают возможностями для "классической" диагностики, но не для ПЦР-диагностики. В современных условиях для генодиагностики необходимы соответствующее оборудование и помещения, обученный персонал. Поэтому генодиагностика проводится в специализированных лабораториях, в том числе в ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ. Цель данного пособия – дать представление о принципах современной генодиагностики и генотипирования ГБМ,преимуществах, показаниях к применению и ограничениях метода, конкретных особенностях созданных нами тест-систем для генодиагностики ГБМ, результатах их практического применения, сравнительной эффективности генодиагностики и правилах клинической интерпретации ее результатов. Таким образом, мы намерены способствовать более широкому использованию генодиагностики ГБМ в здравоохранении, как путем сотрудничества лечебных учреждений со специализированными лабораториями ПЦР-диагностики, так и путем создания подобных лабораторий и групп в составе инфекционных клиник.

Типирование возбудителей ГБМ в настоящее время не имеет клинического значения. Так, например, менингококки могут быть подразделены на серогруппы в соответствии с составом их капсульных полисахаридов, на серотипы и субтипы в соответствии с составом белков наружной мембраны и т.д. Имеются определенные эпидемиологические особенности в заболевании, вызываемом менингококками разных серогрупп - в большинстве стран менингококковая инфекция, вызываемая менингококками серогруппы В, более типична для детей до 5 лет, а случаи заболевания, вызываемого менингококками серогрупп С и А, часто наблюдаются в возрастной группе от 15 до 25 лет. Однако, течение менингококковой инфекции и ее лечение практически не зависит от серогруппы штамма-возбудителя. Частное, но существенное исключение из этого правила - заболевание, вызванное менингококками "редких" серогрупп (W135, Y, X) может указывать на наличие у пациента врожденного дефицита терминальных компонентов комплемента, резко пониженную резистентность к менингококковой инфекции и возможность повторных заболеваний [Платонов 1999а, Платонов 1999б, Приказ № 375].

Тем не менее, типирование возбудителей ГБМ критически важно для эпидемиологического надзора, проведения противоэпидемических мероприятий, краткосрочного и долгосрочного эпидемиологического прогноза. В данном пособии будут рассмотрены основные принципысовременных методов генотипирования и первые результаты их применения в России, а также специфика генотипических подходов, необходимых врачам-эпидемиологам различных уровней.