- •Введение
- •Генодиагностика
- •Олигонуклеотиды для определения принадлежности бактерий к родам Neisseria, Streptococcus и Haemophilus на основе гена 16s рнк.
- •Олигонуклеотиды для определения серогрупповой принадлежности n. Meningitidis на основе генов, участвующих в синтезе капсулы.
- •Условия амплификации для определения родовой принадлежности возбудителя
- •Условия амплификации для определения серогрупповой принадлежности менингококков
- •Данные, необходимые для вычисления чувствительности и специфичности нового теста.
- •Испытания в модельных экспериментах на бактериальные штаммах.
- •Испытания с использованием клинических образцов спинномозговой жидкости: определение родовой принадлежности возбудителей гбм.
- •Результаты диагностики бактериологическим методом, методом латекс-агглютинации (ла) и с помощью полимеразной цепной реакции (пцр).
- •Определение серогруппы менингококка, вызвавшего гбм.
- •Генотипирование
- •Годы изоляции определенных субгрупп n. Meningitidis серогруппы а, Москва 1969-1997 гг.
- •Серологическая характеристика n. Meningitidis серогруппы а, Москва 1969-1997 гг.
- •Аллели генов, отличающие различные генотипы менингококков серогруппы а, эпидемической субгруппы III.
- •Заключение
- •Литература
Испытания с использованием клинических образцов спинномозговой жидкости: определение родовой принадлежности возбудителей гбм.
Было проведено ПЦР-тестирование 173 образцов СМЖ, взятых при поступлении больных с клиническим диагнозом менингококковый менингит (с или без проявлений менингококцемии) или диагнозом ГБМ неясной этиологии во 2ую Инфекционную клиническую больницу г.Москвы (Таблица 4). Бактериологически и/или методом ЛА менингококк был выявлен у 68 больных (39%), пневмококк - у 22 больных (13%), гемофильная палочка типа b - у 9 больных (5%), "прочие" бактерии (K.pneumoniae, E.coli, L.monocytogenous, S.aureus, E.cloacae и др.) - в сумме у 11 больных (6%); 63 случая (36%) не были этиологически расшифрованы с помощью "классических" методов. При этом культивирование само по себе позволяло диагностировать 30-50% эпизодов ГБМ, а метод ЛА - 50-70% эпизодов ГБМ (см. подробнее Таблицу 4).
Таблица 4.
Результаты диагностики бактериологическим методом, методом латекс-агглютинации (ла) и с помощью полимеразной цепной реакции (пцр).
Клинический диагноз при поступлении: в скобках число пациентов / образцов СМЖ, взятых при поступлении |
Диагноз бактерио-логический |
Диагноз методом ЛА |
Диагноз бактерио-логический и / или методом ЛА |
Диагноз методом ПЦР по образцу СМЖ |
Серогруп-пирование методом ПЦР по образцу СМЖ |
|
Возбуди-тель и его серогруппа |
Возбуди-тель и его серогруппа |
Возбуди-тель и его серогруппа |
Возбуди-тель |
Серогруппа возбудителя |
Менингококковая инфекция, менингит, менингококкцемия (78) |
А (12) В (14) С (5) отр. (47) |
А (20) В (10) С (6) отр. (42) |
А (22) В (17) С (9) отр. (30) |
нейссерии (74) отр. (4) |
А (29) В (28) С (13) отр. (8) |
Гнойный бактериальный менингит неясной этиологии. Окончательный диагноз с учетом лабораторных данных - менингококковая инфекция, менингит (35) |
А (3) В (3) С (2) Y(1) отр. (26) |
А (10) В (4) С (4) отр. (17) |
А (11) В (4) С (4) Y(1) отр. (15) |
нейссерии (34) отр. (1) |
А (19) В (3) С (8) истинно-отр. (1)* отр. (4) |
Гнойный бактериальный менингит неясной этиологии. Окончательный диагноз с учетом лабораторных данных - пневмококковый менингит (28) |
пневмо-кокк (14) отр. (14) |
пневмо-кокк (20) отр. (8) |
пневмо-кокк (22) отр. (6) |
стрепто-кокк (27) отр. (1) |
истинно-отр. (28) ** |
Гнойный бактериальный менингит неясной этиологии. Окончательный диагноз с учетом лабораторных данных - менингит, вызванный Hib (9) |
Hib (5) отр. (4) |
Hib(9) отр. (0) |
Hib(9) отр. (0) |
Haemo-philus(9) отр. (0) |
истинно-отр. (9) ** |
Гнойный бактериальный менингит неясной этиологии. Окончательный диагноз с учетом лабораторных данных - менингит, вызванный "прочими" бактериями (11) |
рост бактерий (11) отр. (0) |
отр. (11) |
рост бактерий (11) отр. (0) |
истинно-отр. (11) |
истинно-отр. (11) ** |
Гнойный бактериальный менингит неясной этиологии. Окончательный диагноз с учетом лабораторных данных не уточнен (12) |
отр. (12) |
отр. (12) |
отр. (12) |
отр. (12) |
отр. (12) |
Окончательный диагноз с учетом клинических и лабораторных данных - иные патологии, то есть не "гнойный бактериальный менингит" (78) |
отр. (78) |
отр. (78) |
отр. (78) |
истинно-отр. (78) |
истинно-отр. (78) |
* истинно-отрицательный результат ПЦР серогруппирования образца СМЖ, из которого был высеян штамм менингококков серогруппы. ** истинно-отрицательный результат ПЦР серогруппирования образца СМЖ, из которого был высеяны штаммы иных бактерий (не менингококков).
Применение ПЦР с "родовыми" праймерами позволило выявить присутствие ДНК нейссерий у 108 больных (62%), ДНК стрептококков - у 27 больных (16%), ДНК бактерий рода Haemophilus - у 9 больных (5%). Только 29 образцов СМЖ (17%) были негативны в ПЦР, в том числе 11 образцов, из которых были выделены "прочие" бактерии, принадлежащими к родам, ДНК которых не взаимодействует с нашими праймерами. Использование данных, полученных тремя методами (культура, ЛА и ПЦР) оставило не диагностированными только 15 случаев ГБМ из 173.
Приняв в качестве "золотого стандарта" результаты изоляции штаммов Neisseria, Streptococcus, Haemophilus из образцов СМЖ, можно оценить относительную чувствительность и специфичность наших ПЦР-методик. При ПЦР-исследовании 70 образцов СМЖ, из которых были высеяны бактерии, ложно-отрицательный результат (отсутствие специфического ампликона после ПЦР) был получен в одном случае менингококкового менингита с менингококцемией, а ложно-положительные результаты ("обнаружение" ДНК не того рода бактерий, который был изолирован) не были отмечены. Таким образом, чувствительность ПЦР диагностики ГБМ по предложенной схеме составляет не менее 98%, а специфичность может достигать 100%. Существенно также, что ПЦР-исследование 78 пациентов с иными патологиями (серозный менингит, ОРВИ, и др) не выявляло присутствия в СМЖ бактериальной ДНК.
Аналогичные результаты были получены в более широком испытании "родоспецифических" праймеров, данные которого опубликованы [Платонов 1999г].