22

как описано в табл. 9.4. Количественное определение достигается путем сравнения интенсивностиполученного гибридизационного сигнала с интенсивностью контрольных сигналов гибридизации точно титрованного вируса (разд. 9.6.1.3) или известных количеств РНК, или ДНК, нанесенных на фильтр. Используя разные ДНК-зонды, можно оценить концентрацию индивидуальых компонентов в вирусном препарате и непосредственно определить, содержит ли вирус интересующие нас последоват

Многие из описанных здесь методов титрования исходно создавались для диагностических целей тем не менее они вполне применимы и для исследования антигенного родства между вирусами или механизмов репродукции. Титры инфекционностиодного и того же вируса, определенные разными методами, как правило, неодинаковы. Обычно максимальный титр получают при внутримозговом заражении новорожденных мышат, однако материал из мозга животных иногда невозможно использовать без дополнительной многостадийной очистки. [c.105]

Рабдовирусы, обладающие цитопатогенным действием наклеточные культуры, дают бляшки, число которых пропорционально количеству вируса. Определение числа бляшек, образующихся в результате дегенерации зараженных клеток, лежит в основе наиболее точного метода титрования. Число

бляшек

(х),

сформировавшихся

при

нанесении

на

клеточный

монослой определенного разведения вируса (у) в объеме V, можно использовать

для

расчета

титра

(п)

в

БОЕ/мл

по

уравнению [c.116]

Титрование

вирусов

гриппа

методом

бляшек

[c.178]

Титрование

вируса

методом

бляшек

[c.236]

Использовагтие фрагментов эмбрионов, т. е. кусочков скорлупы 11-дневных оплодотворенных яиц с присоединенной к ним хорионаллантоисной оболочкой,

вместо	целых эмбрионов лежит в	основе весьма экономичного
способа	определения инфекционности	препаратов, содержащих вирус

гриппа. Данный метод, предложенный для титрования вируса гриппа еще до введения в практику культур клеток [14], и теперь весьма полезен для титрования щтаммов вирусов, не размножающихся в культуре клеток или при отсутствии подходящей культуры. [c.176]

При использовании данного метода особенно важен выбор соответствующей клеточной линии. Как правило, инфицирование монослоя клеток ВПК приводит к образованию мелких бляшек. Кроме того, частота их возникновения, как свидетельствует наш опыт, также небольшая. При титровании вируса на [c.276]

Авторы рекомендовали при титровании вирусаполиомиелита методом бляшек в однослойных культурах, выращенных в чаш ках Петри диаметром 60 мм, использовать только те чашки, в которых число колоний не больше 40—50. Однако и при таких условиях около 10% бляшек не могут быть учтены в

результате	слияния. [c.180]
Нередко при работе с малоизученными штаммами или приограниченном
числе пробирок с	культурой тканиэкспериментатору не удается

довести титрование вируса до дозы, дающей 100 /о эффект, В данном случае, как уже упоминалось, оригинальный метод Кербера не может быть использован. Однако ряд авторов на основании весьма сложного теоретического анализа пришел к выводу, что в этих условиях может быть применена измененная формула Кербера. [c.197]

Большим достоинством метода Кербера является возможность вычисления стандартной ошибки. Однако это осуществимо только для тех опытов, в которых испытываются дозы с равными интервалами между ними. Обычно прититровании

вирусов	в		культуре	ткани		указанное условиесоблюдается. [c.198]
Открытие		явления		гемадсорбции у вирусов, активно размножающихся

в культурах ткани, но не вызывающих при этом или вызывающих незначительную дегенерацию, позволило разработать простые методы титрования вирусов и антител. [c.164]

Этот метод подробно описали Роу и сотр. (Rowe et al., 1970). Для титрования вируса-помощника в комплексе Эбелсона мож- [c.385]

Некоторые штаммы вируса бешенства тоже образуют четкие бляшки на монослое клеток хомячка ER в настоящее время эта линия клеток широко используется для размножения ититрования вируса бешенства и других вирусов [17]. Метод бляшек с использованием клеток ER особенно чувствителен прититровании стандартного штамма вируса бешенства VS, При работе этим методом используют монослойные культуры, выращиваемые в шестилуночных планшетах (диаметр лунки составляет 35 мм). [c.117]

Вирусы гриппа — это содержащие однонитевую РНК оболочечные вирусы, вызывающие серьезные эпидемическиезаболевания человека и многих видов животных, в частности лошадей, свиней, тюленей и домашней птицы. Известны три типа данных вирусов, выделенные на основании различий между нуклеокапсидами в реакции связывания комплемента они отличаются также по биохимическим и биологическим свойствам.Вирусы типа А, способные к быстрым и резким изменениямантигенных свойств (антигенный дрейф), являются главной причиной пандемий гриппа человека поэтому они исследованы наиболее подробно. Большинство методов выращивания, очистки и титрования вирусов гриппа разработаны именно для вирусов этого типа. Вирусы типа В, хотя и не способны к антигенному дрейфу, по всем остальным биохимическим и биологическим свойствам очень близки к вирусам типа А поэтому их, как правило, можно выращивать и титровать, пользуясь теми же методами. С другой стороны, вирусы типа С по своимбиохимическим свойствам весьма далеки от вирусов типов А и В соответственно они имеют и другие ростовые свойства. Поскольку вирусы этого типа изучены намного хуже, чем другие, в настоящей главе основное внимание уделено методам, разработанным для вирусов типов А и В, в особенности тем, с которыми авторы знакомы по собственному опыту. Тем не менее большинство этих методов применимы и к вирусам типа С. Данная глава представляет собой практическое руководство, и соответственно теоретические основы методов, как правило, не рассматриваются. При необходимости упоминаются некоторые биологические особенности вирусов и даются ссылки на соответствующую литературу однако полное описание этих свойств можно найти в недавно опубликованных подробных

обзорах	[1—3]. [c.161]
Множество попыток	было предпринято для разработкиудобных

методов титрования медленно растущих вирусов. В большинстве лабораторий остановились на методе определения конечной точки T IDso. Сложность данной проблемы заключается в сохранении клеточного монослоя в течение времени, необходимого для формирования бляшек. В нашей лаборатории используют следующую модификацию метода бляшек, рекомендованную Вентвесом и

Френчем

[28]

[c.289]

Титрование вирусов в однослойных культурах тканей внастоящее время является одним из основных методов ихколичественного определения. Впервые однослойные культуры почечных клеток обезьян для титрования вирусов полиомиелита были предложены Янгнером (1954). Вскоре было показано, что использование однослойных культур позволяет обнаружить цитопатогенные свойства у вирусов E HO и Коксаки, группы осповакцины, у герпетических вирусов, у многих трансмиссивных вирусов, аденовирусов, кори и др. [c.134]

Гош и Янгнер (Gaush, Jonngner, 1959) предложили применятьцветную пробу для титрования вирусов гриппа разных типов и для определения нейтрализующей активности гриппозных сывороток, Авторы использовали для работы клетки почек обезьян. Они показали, что титр, вычисленный по результатамцветной пробы, обычно на 0,56 единицы логарифма ниже по сравнению с результатами титрования во вращающихся пробирках. Метод цветной пробы позволил обнаружить четкиеантигенные различия между щтаммами вирусов гриппа свиней, гриппа А, А2 и В. Была также показана пригодность этого метода для серодиагностики гриппа по нарастанию титра вируснейтрализующих антител в парных сыворотках больных. Отмечена высокая степень корре- [c.161]

Бакли разработала метод титрования антител к ряду трансмиссивных вирусов с помощью реакции задержки гемадсорбции. Первым очень важным моментом является удаление неспецифических ингибиторов гемагглютинации с помощью каолина. Затем сыворотку разводят 1 10 в боратном буфере (pH 9,0). Из данного разведения приготавливают последующие. Равный объем соответствующего разведения сыворотки смешивают с 100 тканевыми гемадсорбирующими дозами. Смесь после инкубации вносят в пробирки с культурой ткани. На 5-й день все культуры исследуют с помощью реакциигемадсорбции. При нейтрализации вируса исследуемой сывороткой гемагглютинины не образовывались и реакция гемадсорбции была отрицательной. [c.166]

Для выращивания однослойных культур рекомендуют использовать флаконы с плоскими стенками. При закрывании флаконов резиновыми пробками отпадает необходимость подачи в термостат воздуха, содержащего Oj. Как показали авторы в специальных опытах, культивирование клеток в герметически закрытых флаконах не отражается на результатах титрованиявируса полиомиелита методом бляшек в сравнении с результатами, полученными при использовании клеток, выращенных в атмосфере СОг. В случае отсутствия небольших стеклянных флаконов, удобных для культивирования клеток, можно использовать чашки Петри, как это предлагают С. Г. Дзагуров и К- Т. Касымов (1957). В своих опытах они применяли чашки, края которых были склеены лейкопластырем, что создавало достаточную герметичность. По сообщению Гендерсона и Тейлора (1959), удобными для получения бляшек оказались также культуры, выращенные в пробирках. Правда, использование таких культур не может найти применение приизучении вирусов, которые образуют крупные колонии, так какклеточный слой в пробирке весьма невелик по площади. [c.169]

Эти наблюдения побудили авторов использовать культуры данного типа для титрования вируса лимфоцитарного хориоме-нингита по методу бляшек. В чашки Петри диаметром 10 см вносят 10 мл клеточной взвеси, содержащей 1,2— 1,5X10 клеток и 1 мл. После формирования монослоя в каждую чашку вносили 0,5 мл соответствующего разведения вируса. Период адсорбциисоставлял Vi часа. Затем в чашки наливали по 4 мл покрытия, состоящего из 15% триптозофосфатного бульона, 1% агара и 84% среды 199На 2-, 6- и 10-й день в

чашки вносили дополнительно по 3 мл покрытия, причем в последний раз питательная смесьсодержала нейтральный красный в концентрации 1 8000.

[c.172]

Были проведены опыты, чтобы выяснить возможность применения отечественных образцов нейтрального красного при титровании вирусов методом бляшек. Во всех опытах при использова НИИ препаратов фирмы Дифко и образцов, изготовляемых нашими заводами, получались одинаковые результаты. [c.173]

Титрование методом бляшек вируса лолиомиелита типа I (штамм 54—1342)

в	культуре	почечного	эпителия	обезьян	[c.178]
Титрование методом бляшек вируса полиомиелита типа I (штамм Брундеи) в
разных		культурах		ткани	[c.182]

ТТрежде чем изложить технику вычисления по методу Рида и Менча, остановимся на тех условиях, соблюдение которых обязательно при данном методе. Принцип кумуляции предполагает,, Дчто, ЛНтервалы между всеми исследуемыми дозами представляют одинаковую величину (обычно прититровании вирусов разница между логарифмами двух соседних доз составляет 0,5 или 1). При вирусологических исследованияхважно, чтобы каждым исследуемым разведением вируса заражалось равное число жи-" вотных, к сожалению, это требование не всегда выполняется. Беренс (1929) рекомендовал использовать не менее 6 особей для испытания одной дозы, однако, в последующем стали ограничиваться 4 животными. Попытки некоторых авторов ограничиться [c.190]

Обработка результатов титрования вируса полиомиелита в культуре ткаки по методу Рида и Менча [c.192]

Сообщение Д Эрреля вызвало сенсацию среди медицинских микробиологов, поскольку он высказал идеи о роли фагов вразвитии естественного иммунитета и об их использовании в борьбе с инфекционными болезнями. Несмотря на такие весьма ошибочные заявления, Д Эррель довольно близко подошел ксовременному представлению о фагах. С самого начала своих исследований Д Эррель считал, что фаги — это особые невидимые фильтрующиеся, самовоспроизводящиеся вирусы, облигатно паразитирующие на бактериях. В течение двух-трех лет со времени своего открытия он разработал метод точного подсчета, или титрования, фагов, а к 1923 г. он описал их жизненный циклследующим образом фаговые частицы прикрепляются кповерхности бактерии и затем проникают в клетки, где они размножаются, образуя потомство многих вирусных частиц. После разрушения, или лизиса, клетки эти частицы выходят вокружающую среду вполне готовыми к новому заражению. [c.252]

Пуэ [20] и Перлманн с сотр. [19] показали, что после обработки препаратов ГТХ человека нейраминидазой ихэлектрофоретическая подвижность изменяется приблизительно от —8,4-10" до —6,7-10 см сек в при pH 7. Это может происходить в результате уменьшения отрицательного или (по данным титрования) увеличения положительного заряда ГТХ. При pH 7гидроксильная группа тирозина не заряжена и не может обусловливать такое изменение в подвижности. Пейп и Максфилд[45] нашли, что молярное количество аргинина в ГТХ, определенное по методу Сакагучи, увеличивается после действия нейраминидазы пропорционально количеству отщепленной NANA. Благодаря этому факту становится понятнымобнаруженное увеличение положительного заряда, о котором было сказано ранее. В противоположность необычному

поведению тирозина в ГТХ человека увеличение количествааргинина наблюдается в каждом из четырех исследованных гликопротеинов, оказывающих тормозящее действие на реакцию гемагглютинации под действием вирусов. В гликопротеипе, не оказывающем тормозящего действия (например, в фетуине), никаких изменений количества аргинина не обнаружено.

94 классификация ротавирусов

Ротавирусная инфекция

Ротавирусная инфекция (кишечный грипп) – заболевание инфекционной природы, которое вызывает ротавирусы. Для данного заболевания характерно острое начало, клиническая картина схожа с энтеритами и гастроэнтеритами, а также в начальном периоде заболевания наблюдается сочетание респираторного и кишечного синдрома.

Виды ротавирусной инфекции

Существует 9 видов ротавирусов в природе. Из них 5 паразитируют в организме человека. Различают такие виды ротаровирусной инфекции: А, В, С, Д, Е. Чаще всего именно ротавирус А вызывает признаки энтероколита. Одновременно может происходить инфицирование другими ротавирусами (например, С и В).

Симптомы

Симптомы ротавирусной инфекции зависят от степени тяжести заболевания. Симптомы легкой стадии заболевания:

частота испражнений не превышает 5 раз в день;

испражнения кашицеобразные;

рвота однократная или может вообще отсутствовать;

температура нормальная (чаще всего);

интоксикация либо отсутствует, либо слабо выраженная.

Симптомы среднетяжелой стадии заболевания:

частота испражнений до десяти раз в сутки;

характерна тошнота и рвота;

рвота до 4 раз в день;

рвота заканчивается в течение суток;

возможно кратковременное увеличение температуры тела;

умеренные симптомы интоксикации организма;

эксикоз (возможен).

Симптомы тяжелой стадии заболевания:

частота испражнений превышает десять раз в стуки;

характерно увеличение температуры тела;

частая рвота;

тяжелая интоксикация организма.

Симптомы ротавирусной инфекции, характерные в той или иной степени всем стадиям заболевания:

диарея;

стул водянистый, пенистого вида;

чаще всего стул имеет желтый цвет;

дефекация сопровождается резким запахом;

боли в животе;

вздутие живота;

урчание и дискомфорт в кишечнике;

катар верхних дыхательных путей (в 20 % случаях);

гиперемия и зернистость слизистой мягкого неба, глотки и ее задней стенки и небных радужек;

кашель;

дискомфорт и першение в горле;

возможен эпидемический и единичный характер болезни.

Симптомы ротавирусной инфекции у детей до года:

обезвоживание организма;

нарушение водно-солевого баланса;

интенсивная диарея;

боли в животе;

характерно для детей с перинатальным поражением нервной системы, экссудативным диатезом, ВУИ и детей, которые находятся на искусственном вскармливании;

характерно развитие вторичной лактозной недостаточности;

чаще всего заболевание имеет форму микс-инфекции (сочетает несколько кишечных инфекций: шигеллез, сальмонеллёз и другие);

лихорадка;

эксикоз и токсикоз;

длительность заболевания до трех недель (возможен летальный исход).

Уноворожденных и у детей первого года жизни данная инфекция развивается довольно редко. Заражение происходит от персонала роддомов и матери. Случаются как групповые так и спорадические вспышки.

Диагностика

При появлении первых симптомов болезни необходимо записаться на прием к

врачу-гастроэнтерологу. Врач проведен первичный осмотр и консультацию. Для подтверждения диагноза назначают множество лабораторных диагностики, одни из которых:

общий анализ крови;

реакция пассивной гемагглютинации;

полимеразная цепная реакция;

реакция связывания комплимента;

иммунофлуоресценция.

95. полиомиелит Возбудитель полиомиелита. Таксономия и характеристика. Лабораторная

диагностика. Специфическая профилактика.

Таксономия.: семейство Picornaviridae, род Enterovims, вид Poliovirus.

Структура. По структуре полиовирусы - типичные представители рода Enterovirus. РНК-содержащие вирусы.

Морфология: мелкие, просто организованные вирусы, сферической формы, состоят из одноцепочечной РНК и капсида.

Культивирование: Хорошо репродуцируются в первичных и перевариваемых культурах клеток из тканей человека и сопровождается цитопатическим эффектом. В культуре клеток под агаровым покрытием энтеровирусы образуют бляшки.

Антигенные свойства: Различают 3 серотипа внутри вида: 1, 2, 3, не вызывающие перекрестного иммунитета. Все серотипы патогенны дл человека. Патогенез и клиника. Естественная восприимчивость человека к вирусам полиомиелита высокая. Входными воротами служат слизистые оболочки верхних дыхательных путей и пищеварительного тракта. Первичная репродукция вирусов происходит в лимфатических узлах глоточного кольца и тонкой кишки. Из лимфатической системы вирусы проникают в кровь, а затем в ЦНС, где избирательно поражают клетки передних рогов спинного мозга (двигательные нейроны). Инкубационный период продолжается в среднем 7-14 дней. Различают 3 клинические формы полиомиелита: паралитическую, менингеальную (без

параличей), абортивную (легкая форма). Заболевание начинается с повышения температуры тела, общего недомогания, головных болей, рвоты, болей в горле. Иммунитет. После перенесенной болезни остается пожизненный типоспецифический иммунитет. Иммунитет определяется наличием вируснейтрализующих антител, среди которых важная роль принадлежит местным секреторным антителам слизистой оболочки глотки и кишечника (местный иммунитет). Пассивный естественный иммунитет сохраняется в течение 3-5 недель после рождения ребенка.

Микробиологическая диагностика. Материал для исследования - кал,

отделяемое носоглотки, при летальных исходах - кусочки головного и спинного мозга, лимфатические узлы.

Вирусы полиомиелита выделяют путем заражения исследуемым материалом первичных и перевиваемых культур клеток. О репродукции вирусов судят по цитопатическому действию. Идентифицируют выделенный вирус с помощью типоспецифических сывороток в реакции нейтрализации в культуре клеток. Важное значение имеет внутривидовая дифференциация вирусов, которая позволяет отличить патогенные штаммы от вакцинных штаммов, выделяющихся от людей, иммунизированных живой полиомиелитной вакциной. Различия между штаммами выявляют с помощью ИФА, реакции нейтрализации цитопатического действия вируса в культуре клеток со штаммоспецифической иммунной сывороткой, а также в ПЦР.

Серодиагностика основана на использовании парных сывороток больных с применением эталонных штаммов вируса в качестве диагностикума. Содержание сывороточных иммуноглобулинов классов IgG, IgA, IgM определяют методом радиальной иммунодиффузии по Манчини.

110 внутрисосудист инфекции

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КРОВИ

Сепсис и бактериемию могут вызывать многие микроорганизмы, относящиеся как к патогенным, так и к условно-патогенным.

Наибольшее значение при этом имеют:

−Staphylococcus aureus

−Streptococcus pyogenes

−Aerococcus viridans

−Pseudomonas aeruginosa;

−Представители родов: Klebsiella, Yersinia, Candida и др.

Взятие исследуемого материала

Кровь для посева берут, соблюдая правила асептики, чтобы избежать попадания микроорганизмов из внешней среды. Посев проводят во время подъема температуры, в начале появления лихорадки.

Кровь забирают до начала антибактериального или химиотерапевтического лечения или через 12–24 часа после последнего введения препарата. Для бактериологического исследования необходимо сеять достаточные количества крови (у взрослых не менее 10 мл и 5 мл у детей) для того, чтобы путем разведения крови (1:10–1:60) преодолеть ее естественные бактерицидные свойства. Для нейтрализации антибактериальных факторов крови, в том числе комплимента, рекомендуется применять 0,025–0,03% полианитол-сульфонат натрия.

При наличии у пациента подключичного катетера или капельницы в вене, можно воспользоваться ими для получения крови. Небольшому количеству крови дают свободно вытечь в

пробирку, а затем ее набирают в шприц для посева. Для бактериологического исследования необходимо забрать 12– 20 мл крови, которую тут же засевают на питательные среды. Для получения толстой капли» одну каплю крови из шприца ли системы помещают на предметное стекло и

подсушивают ее на воздухе, фиксируют метиловым спиртом или смесью Никифорова (спирт-эфир) и окрашивают раствором метиленового синего или методом Романовского-Гимзе._

_