22

13. методы стерилизации посуды и питательных сред. Номенклатура по Берджи Стерилизацию питательных сред осуществляют различными способами в

зависимости от тех ингредиентов, которые входят в их состав. Синтетические среды и все агаровые среды, не содержащие в своем составе нативного белка и углеводов, стерилизуют 15-20 мин в автоклаве при температуре 115-120°С.

Среды с углеводами и молоком, питательный желатин стерилизуют текучим паром при температуре 100°С дробно или в автоклаве при 112°С.

Среды, в состав которых входят белковые вещества (сыворотка крови, асцитическая жидкость), обеспложиваются тиндализацией или фильтрованием. Для стерилизации питательных сред, содержащих в своем составе нативные белки, пользуются фильтрацией через мембранные фильтры Зейтца.

Подготовка к стерилизации лабораторной посуды

Перед стерилизацией лабораторную посуду тщательно моют и сушат. Пробирки, флаконы, бутылки, матрацы, колбы закрывают ватно-марлевыми пробками. Поверх пробки на каждый сосуд (кроме пробирок) надевают бумажный колпачек.

Чашки Петри стерилизуют завернутыми в бумагу по 1-5 штук или в пеналах. Пастеровские пипетки по 3-5-10-15 штук заворачивают в плотную оберточную бумагу. В верхнюю часть каждой пипетки вкладывают кусочек ваты. Во время работы пипетки из пакета вынимают за верхний конец.

Лабораторную посуду стерилизуют:

а) сухим жаром при температуре 150, 160 и 180?С соответственно 2 часа, 1 час и 30 минут.

б) в автоклаве при давлении 1 атм. В течение 20-30 минут Определитель Берджи систематизирует все известные бактерии по нашедшим в практической бактериологии наибольшее распространение принципам

идентификации бактерий, основанным на различиях в строении клеточной стенки и отношении к окраске по Граму. Определи -тель выделяет четыре основных категории бактерий — Gracillicutes [от лат. gracilis, изящный, тонкий, + cutis, кожа] — виды с тонкой клеточной стенкой, окрашивающиеся грамотрицательно; firmicutes [от лат. flrmus, крепкий, + cutis, кожа] — бактерии с толстой клеточной стенкой, окрашивающиеся грамположительно; Tenericutes [от лат. tener, нежный, + cutis, кожа] — бактерии, лишённые клеточной стенки (микоплазмы и прочие представители класса Mollicutes) и Mendosicutes [от лат. mendosus, неправильный, + cutis, кожа] — архебакте-рии (метан- и сульфатредуцирующие, галофильные, термофильные и архебактерии, лишённые клеточной стенки). Описание бактерий даётся по группам (секциям), в состав которых включены семейства, роды и виды; в некоторых случаях в состав групп входят классы и порядки. Патогенные для человека бактерии входят в небольшое число групп.

14. принципы и механизмы иммунологических реакций

Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии:

1.стадия узнавания тестируемого соединения специфическим к нему антителом, что ведет к образованию иммунного комплекса;

2.стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со

свободными местами связывания; 3. стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал. Классификация ИФА.

В основу классификации методов ИФА положено несколько подходов:

1. По типу реагентов, присутствующих на первой стадии ИФА, различают конкурентный и неконкурентный методы.

А) В конкурентном ИФА на первой стадии в системе присутствуют одновременно анализируемое соединение и его аналог, меченный ферментном и конкурирующий за центры специфического связывания с ним.

Б) Для неконкурентных методов характерно присутствие в системе на первой стадии только анализируемого соединения и специфичных к нему центров связывания.

2. Все методы ИФА делются на гомогенные и гетерогенные.

В основе гомогенного ИФА для определения низкомолекулярных субстанций, лежит ингибирования активности фермента при его соединении с антигеном или антителом. Активность фермента восстанавливается в результате реакции антиген-антитело.

При связывании антитела с антигеном, содержащим ферментную метку, происходит ингибирование активности фермента на 95% по отношению к высокомолекулярному субстрату, что обусловлено стерическим исключением субстрата из активного центра фермента. По мере увеличения концентрации антигена связывается все больше антител и сохраняется все больше свободных конъюгатов антиген-фермент, способных гидролизовать высокомолекулярный субстрат. Для гетерогенных методом характерно проведение анализа в двухфазной системе с участием твердой фазы – носителя, и обязательная стадия разделения иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов (отмывка), которые находятся в разных фазах (образовавшиеся иммунные комплексы находятся на твердой фазе, а непрореагировавшие комплексы – в растворе). Гетерогенные методы, в которых формирование иммунных комплексов на первой стадии протекает на твердой фазе, называют твердофазными методами.

3. По принципу определения тестируемого вещества:

А) Прямое определение концентрации вещества (антигена или антитела) по числу провзаимодействующих с ним центров связывания. ферментная метка будет находиться в образовавшемся специфическом комплексе АГ-АТ.

Концентрация определяемого вещества будет прямо пропорциональна регистрируемому сигналу.

Б) Определение концентрации вещества по разности общего числа мест связывания и оставшихся свободными центров связывания. Концентрация определяемого вещества при этом будет возрастать, а регистрируемый сигнал снижатьсяХарактеристика компонентов, используемых в ИФА.

Ферментные маркеры, используемые в ИФА, должны обладать следующими свойствами:

–высокая активность и стабильность фермента в условиях анализа, при модификации и в конъюгате с антителами или другими белками;

–наличие чувствительных субстратов и простота метода определения продуктов или субстратов ферментативной реакции;

–возможность адаптации субстратных систем к дальнейшему усилению;

–отсутствие фермента и его ингибиторов в исследуемой биологической жидкости.

15. метод гибридизации рнк днк бсг пцр

Саузерн-блот гибридизация - метод анализа структуры заданной области генома, основанный на:

-1) расщеплении геномной ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции ;

-2) разделении множества полученных фрагментов с помощью электрофореза в

плоской пластине агарозного или другого геля; - 3) перенесении продуктов разделения на лист пористого материала, например,

на нитроцеллюлозный фильтр таким образом, что все фрагменты ДНК переносятся на фильтр и закрепляются на нем, создавая отпечаток, идентичный распределению фрагментов в геле после разделения; - 4) гибридизации фильтра с меченым радиоактивно или с помощью красителя

фрагментом ДНК или РНК (пробой), который по последовательности соответствует анализируемому участку генома. В результате, проба за счет комплементарных взаимодействий связывается с теми участками фильтра, где находятся исследуемые фрагменты генома, и положение этих фрагментов идентифицируется по положению метки из пробы на фильтре.

Гибридизация in situ. Метод гибридизации с ДНК-зондами на гистологических или хромосомных препаратах (т.е. метод гибридизации, не требующий предварительного выделения и очистки ДНК). В настоящее время наиболее широко используется FISH (от англ. fluorescent in situ hybridization) — вариант метода, при котором в качестве зондов используют препараты ДНК или РНК, меченные флуорохромами.

Принцип метода:

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты: ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.

Праймеры- короткие синтетические олигонуклеотиды длиной 18—30 оснований комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.

Термостабильная ДНК-полимераза— фермент, катализирующий реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время. Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции.

Реакция проводится в 30-50 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий Денатурация. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96°C (или до 98°C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 мин., чтобы цепи ДНК разошлись. Иногда перед первым циклом (до добавления полимеразы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 мин. для полной денатурации матрицы и праймеров. Такой приём называется горячим стартом, он позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.

Отжиг. Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 4—5°С ниже их температуры плавления. Время стадии— 0,5—2 мин. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре).

Элонгация. ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки.Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72°C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов

часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7-10 мин.

Количество специфического продукта реакции (ограниченного праймерами) растет экспоненциально, а количество «длинных» копий ДНК линейно, поэтому в продуктах реакции доминирует специфический фрагмент ДНК. Через некоторое количество циклов рост количества продуктов замедляется за счет ограничения количества реагентов, наличия ингибиторов, появления побочных продуктов реакции.

ПЦР реального времени (real-time PCR)

Real-time PCR это группа методик, дающие возможность качественного анализа продуктов ПЦР в режиме реального времени по ходу проведения реакции. Основными этапами данного метода являются:

Определение выхода продукта реакции после каждого цикла амплификации. Построение по этим данным кинетической кривой PCR.

Определение относительной концентрации субстрата на основании анализа этой кривой.

Для детекции PCR-продукта используются флуоресцентные красители, обеспечивающие флуоресценцию, прямо пропорциональную количеству ПЦРпродукта - репортерную флуоресценцию. Механизмы ее генерации различаются в зависимости от конкретного типа real-time PCR.

Кинетическая кривая PCR в координатах "Уровень репортерной флуоресценции

— цикл амплификации" имеет S-образную форму. В ней можно выделить три стадии:

Стадию инициации (когда PCR-продукты еще не детектируется флуоресцентной меткой).

Экспоненциальную стадию (в которой наблюдается экспоненциальная зависимость количества флуоресценции от цикла PCR).

Плато (стадию насыщения).

Исходное количество субстрата определяется по пороговому циклу (threshold cycle) такой цикл n, на котором достигается некий заданный уровень репортерной флуоресценции - пороговая флуоресценция при условии, что эффективность реакции и заданный уровень пороговой флуоресценции одинаковы для каждой из сравниваемых реакций.

Варианты real-time PCR различаются по способам генерации репортерной флуоресценции. Применение интеркалирующих флуоресцентных агентов, флуоресценция которых значительно возрастает при связывании с двуцепочечной ДНК, Использование меченых флуоресцентными агентами олигонуклеотидных проб,

комплементарных участку PCR-продукта.

16. определение чувствительности микроорг

Определение чувствительности микроорганизмов – возбудителей инфекционных заболеваний человека к антибактериальным препаратам (АБП)

Стандартные методы определения чувствительности микроорганизмов к АБП

Современные стандартизованные методы определения чувствительности микроорганизмов к АБП подразделяют на методы серийных разведений и диско-диффузионные. Методы серийных разведений основаны на прямом определении

основного количественного показателя, характеризующего микробиологическую активность АБП – величину его минимальной подавляющей концентрации (МПК).

МПК – минимальная концентрация, подавляющая видимый рост исследуемого микроорганизма в бульонной культуре или на плотной среде. Для определения МПК заданные концентрации АБП вносят в питательную среду, которую затем засевают культурой исследуемого

микроорганизма и после инкубации оценивают наличие или отсутствие видимого роста.

В зависимости от характера используемой питательной среды различают методы серийных разведений в агаре или в бульоне. В зависимости от объема используемой жидкой питательной среды выделяют методы серийных макро- и микроразведений. Разновидностью метода серийных

разведений является также метод, основанный на использовании только двух концентраций АБП, соответствующих пограничным значениям МПК.

Диффузионные методы определения чувствительности основаны на диффузии АБП из носителя в плотную питательную среду и подавлении роста исследуемой культуры в той зоне, где концентрация АБП превосходит МПК. В настоящее время существуют две основные модификации диффузионного метода: диско-диффузионный и Е-тест. В дискодиффузионном методе в качестве носителя АБП используют бумажный диск. Образование зоны подавления роста происходит в результате диффузии АБП из носителя в питательную среду. В определенных пределах величина диаметра зоны подавления роста обратно пропорциональна МПК. Однако диско-диффузионный метод позволяет лишь косвенно судить о величине МПК, а результатом исследования является отнесение микроорганизма к одной из категорий чувствительности (чувствительный, промежуточный или

резистентный). Е-тест представляет собой узкую полоскуполимера (0,5х6 см), на которую нанесен градиент концентраций АБП (от минимальных до максимальных).

Подавление роста микроорганизма вокруг полоски Е-теста происходит только в той зоне, где концентрация АБП, диффундирующего из носителя, выше МПК, при этом образуется каплевидная зона ингибиции. Значения концентрации АБП в каждом участке носителя типографским способом нанесены на наружной (обращенной к исследователю)

поверхности Е-теста. Величину МПК учитывают в том месте, где граница зоны подавления роста вплотную подходит к носителю. Детальные инструкции по определению чувствительности с использованием Е-тестов прилагаются изготовителем к набору реактивов.

17. Диско-диффузионный метод определения чувствительности бактерий к антибактериальным препаратам. Понятие о класс-дисках. Контроль дисков. Контрольные типовые штаммы. Контроль качества исследования.Данный метод основан на способности АБП диффундировать из пропитанных ими бумажных дисков в питательную среду, угнетая рост микроорганизмов, посеянных на поверхности агара. При определении чувствительности ДДМ толщина слоя агара в чашке 4,0±0,5 мм Для определения чувствительности ДДМ следует использовать только стандартизированные качественные диски. Для инокуляции приготовленных чашек с агаром используют два способа:

1.Наиболее удобным способом инокуляции является использование стерильных ватных тампонов. Тампон погружают в стандартную суспензию микроорганизма, затем избыток инокулюма удаляют, отжав тампон о стенки пробирки. Инокуляцию проводят штриховыми движениями в трех направлениях, поворачивая чашку Петри на 60°.

2.При использовании второго способа стандартный

инокулюм наносят пипеткой на поверхность чашки Петри с питательной средой в объеме 1–2 мл, равномерно распределяют по поверхности покачиванием, после чего удаляют избыток инокулюма пипеткой.

Не позднее 15 мин. после инокуляции на поверхность питательной среды наносят диски с АБП. Их аппликацию проводят с помощью стерильного пинцета или автоматического диспенсера. Расстояние от диска до края чашки и между дисками должно составлять 15–20 мм. Таким образом, на одну чашку диаметром 100 мм помещается не более 6 дисков с АБП. Диски должны равномерно контактировать с поверхностью агара, для чего их прижимают пинцетом. После аппликации дисков чашки Петри помещают в термостат вверх дном и инкубируют при температуре 35°С в течение 18–24 ч (в зависимости от вида тестируемого микроорганизма).

После окончания инкубации чашки помещают вверх дном на темную матовую поверхность так, чтобы свет падал на них под углом в 45° (учет в отраженном свете). Диаметр зон задержки роста измеряют с точностью до 1 мм, предпочтительнее пользоваться штангенциркулем или кронциркулем (рис. 3).

При измерении зон задержки роста следует ориентироваться на зону полного подавления видимого роста. Не следует обращать внимания на очень мелкие колонии,

выявляемые в пределах зоны задержки роста только при особых условиях освещения или при увеличении. Крупные колонии, выявляемые в пределах четкой зоны подавления роста, свидетельствуют о наличии посторонней микрофлоры или о гетерорезистентности популяции микроорганизмов, в этом случае необходимо повторить идентификацию микроорганизма, формирующего эту колонию, и определение чувствительности данного штамма.

18. ускоренные методы определения чувствительности. Метод прямого посева

Автоматический посев:

1.С помощью прецизионных шприцев прибор отбирает точное количество подготовленного материала через стилус – тонкий капилляр из мягкого пластика.

2.Стилус опускается на поверхность агара в центр чашки Петри, укрепленной на

вращающемся столике.

3.При касании агара из стилуса равномерно и точно начинает поступать посевной материал. В зависимости от моделей приборов посев может быть равномерным (сплошным или гомогенным)(1), спиральным (экспоненциальным) (2), концентрическим (круговым) (3) или глубинным (в толщу агара) (4), что показано на рисунке.

4.После посева стилус промывается антисептическим раствором, далее многократно промывается стерильной дистиллированной водой. После этого он готов к посеву нового образца.

С использованием метода нанесения образца Spiral® в логарифмической последовательности уменьшается объем образца, распределяемого по чашке Петри в виде Архимедовой спирали от центра к краю. При этом можно откалибровать объем нанесенного образца в каждой точке площади посева. Концентрация микроорганизмов определяется по количеству колоний, обнаруженных в единице объема нанесенного образца в каждом секторе чашки.

Особенности приборов для автоматических посевов в микробиологических исследованиях:

Максимальная стандартизация процедуры микробиологического посева Возможность установки в ламинарный шкаф Уникальная система дезинфекции, которая обеспечивает стерилизацию устройства с отсутствием риска перекресобразцов Высокая точность объемов нанесения образцов - 0,5%

Выбор одного из 4-х методов посева на чашки, диаметром 55, 90 или 150 мм Высокая скорость разведения образца и его посева (один полный цикл, включающий в себя обеззараживание, си посев занимает около двух минут) Ускоренные методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам

В практике лабораторий ускоренное определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам и другим химиотерапевтическим препаратам осуществляется некоторыми зарубежными автоматизированными системами микробиологических исследований (MS-2, Qantum 2, Sceptor и др.). В кюветах панели содержатся дегидрированные субстраты или диски с антибиотиками. Каждый антибиотик в кювете представлен в одной концентрации, соответствующей критерию принадлежности бактерий к группе "чувствительных" к антибиотику. Одновременно тестируется 20 и более антибиотиков. После внесения взвеси испытуемых бактерий посевы инкубируют при 35-37°С в течение 4-5 ч. Результаты регистрируют спектрофотометрически или кондуктометрически сразу при появлении размножения бактерий в контроле без антибиотика.

Для ускоренного определения чувствительности или устойчивости бактерий к бета-лактамным антибиотикам широко используются различные методы выявления бета-лактамазной активности бактерий. Представляем один из методов определения бета-лактамазы бактерий (Сиволодский Е.П., 1980). На фильтровальную бумагу (2х2 см) в чашке Петри наносят одну каплю 2% раствора водорастворимого крахмала. После ее впитывания наносят петлей в центр бумаги

агаровую культуру испытуемых бактерий (например, стафилококков) и растирают в виде бляшки диаметром 3-4 мм. На поверхность бляшки наносят одну каплю (0,05 мл) рабочего йодного раствора бензил-пенициллина. После экспозиции 10 мин при комнатной температуре учитывают результаты реакции. Наличие беталактамазы: на темно-синем фоне четкая зона полного просветления вокруг бляшек бактерий. Отсутствие бета-лактамазы: на темно-синем фоне нет зоны просветления вокруг бляшки, края бляшки нечеткие, сливаются с фоном. Наличие бета-лактамазы указывает на устойчивость бактерий к антибиотику.

Реактивы на бета-лактамазу: реактив №1 - 0,005-молярный раствор йода (йод -1,27 мг/мл, калия йодид -15 мг/мл; 1/15 -молярный фосфатный буфер рН 6,5 до необходимого объема); реактив №2 - 2% раствор водорастворимого крахмала; реактив №3 - рабочий йодный раствор бензилпенициллина (во флакон, содержащий 500 000 ED бензилпенициллина, вносят 10 мл реактива № 1), годен в течение 2 ч.

19. нормальная микрофлора.

Под нормальной микрофлорой понимают совокупность всех сложных эволюционно-закрепленных микробиоценозов органов и тканей или участков тела, контактирующих с внешней средой (индигенная флора, аутофлора, аутохтонная, эубиоз, резидентная микрофлора).

Нормофлора включает в себя свыше 500 видов микроорганизмов с общим числом более 1014 клеток. На состав микрофлоры влияют:

тип дыхания, наличие питательного субстрата,

физико-химические условия среды, наличие бактерицидных факторов, микробный антагонизм, развитость и состояние иммунной защиты.

Большое значение в изучении нормальной микрофлоры играет гнотобиология - наука, которая изучает жизнь макроорганизма не примере специально выращенных безмикробных животных.

. Выдены следующие функции нормальной микрофлоры:

-блокирование рецепторов адгезии;

-антагонистическая, за счет продукции короткоцепочечных жирных кислот, перекисей, бактериоцинов и других антимикробных субстанций;

-витаминообразующая;

-участие в пищеварении;

-участие в минеральном обмене (Ca, Na, K, Fe, Mg и др.);

-детоксикация ксенобиотиков за счет их адсорбции или биотрансформации;

-индукция иммунного ответа, продукция стимуляторов и активаторов фагоцитарной и ферментативной активности;

-стимуляция обновления эпителия на поверхности ворсинок и др.;

-противоопухолевая;

-регуляция всасывания и др.

Микробный состав отдельных биотопов требует отдельного рассмотрения. Механизм формирования нормальной микрофлоры.

Нормальная микрофлора формируется в процессе жизни человека при активном участии самого макроорганизма и различных сочленов биоценоза. Первичное заселение микробами организма, стерильного до рождения, происходит в процессе родов, а затем микрофлора формируется под влиянием окружающей ребенка внешней среды и прежде всего при контакте с ухаживающими за ним людьми. Огромную роль в становлении микрофлоры играет питание.